Sfondi

Teknologjia e Bibliotekës së Peptideve të Shfaqjes së Fagut funksionon duke bashkuar gjenet që kodojnë sekuenca të rastësishme peptidesh me gjenet që kodojnë proteinat e mbulesës së fagut. Peptidet shfaqen si pasojë në sipërfaqen e fagut ndërsa proteinat e mbulesës shprehen. Më e rëndësishmja, sekuenca e ADN-së që kodon ruhet brenda grimcës së fagut. Në sistemin e shqyrtimit të bazuar në fag, kjo krijon një marrëdhënie të drejtpërdrejtë gjenotipi-fenotip. Krahasuar me bibliotekat tradicionale të peptideve të sintetizuara kimikisht, shfaqja e fagut ofron avantazhe të dallueshme: kosto më të ulët, diversitet më të lartë dhe përputhshmëri me objektiva jo-proteinike. Aplikohet gjerësisht në hartëzimin e epitopeve dhe njohjen e synuar.

Procesi thelbësor i ndërtimit dhe shqyrtimit të bibliotekës së peptideve

Ndërtimi i Bibliotekës së Peptideve

Ndërtimi i një biblioteke peptidesh të shfaqjes së rastësishme të fagut lejon përzgjedhjen e peptideve lineare ose të kufizuara (ciklike) bazuar në vetitë e synuara. Skema e kodonit NNK (N: nukleotid i rastësishëm; K: G ose T) përdoret për të minimizuar frekuencën e kodonit ndalues dhe për të maksimizuar diversitetin e aminoacideve. Kjo skemë zvogëlon probabilitetin e kodonit ndalues dhe siguron kodim të rastësishëm të të 20 aminoacideve natyrore.

Vektorë të ndryshëm të fagëve janë të disponueshëm

Bashkimi i pIII C-terminal

Valencë e ulët (1-5 kopje/fag), e përshtatshme për shqyrtim me afinitet të lartë.

Bashkimi N-terminal i pVIII

Bashkimi N-terminal i P(ii) pVIII: Valencë e lartë (>2000 kopje/fag), duke shfrytëzuar efektet e aviditetit për të kapur lidhësit e dobët.

Fragmentet e pastruara të ADN-së lidhen në një vektor fagmid (p.sh., pComb3) duke përdorur ligazën e ADN-së T4. Përzierja e lidhjes transformohet në E. coli ER2738 nëpërmjet elektroporimit me tension të lartë, duke arritur një madhësi biblioteke që tejkalon 109 klone të pavarura. Fagu ndihmës M13KO7 inkubohet me kulturën e transformuar në mënyrë që ta superinfektojë atë. Grimcat e fagut që shfaqin bibliotekën e peptideve më pas mblidhen nëpërmjet reshjes PEG/NaCl.

Biopanim

Biopanifikimi pasuron peptidet specifike për shënjestrën përmes cikleve iterative të Lidhjes, Larjes, Elucionit dhe Amplifikimit:

Fig. 1 Biopanimim[1]

Lidhja

Shënjestra imobilizohet (p.sh., veshet mbi puse polistireni në 10-100 μg/ml) ose kapet (p.sh., shënjestra e biotiniluar lidhet me sfera magnetike të veshura me streptavidinë për shqyrtimin e fazës së tretësirës). Biblioteka e fagut (10^11 pfu) shtohet dhe inkubohet me tundje të lehtë në temperaturën e dhomës për 1 orë.

Larje

Fagët jo të lidhur në mënyrë specifike hiqen nëpërmjet larjeve progresive rigoroze. Raundet fillestare përdorin TBST (0.1% Tween-20) për 10 larje; raundet pasuese rriten në 20 larje dhe mund të përfshijnë 0.5 M NaCl.

Elucion

Fagët e lidhur posaçërisht eluohen: lidhësit e fortë nëpërmjet elucionit acid (0.1 M glicinë-HCl, pH 2.2 për 2 minuta, neutralizohen menjëherë); lidhësit e dobët nëpërmjet elucionit konkurrues duke përdorur shënjestër të tretshme.

Amplifikim

Fagu i eluuar infekton qelizat ER2738 të fazës log. Pas superinfeksionit të fagut ndihmës, grupi i fagëve amplifikohet për raundin tjetër të panimit. Në mënyrë tipike, pas 3-4 raundeve, një rritje e konsiderueshme në titrin e fagut të rikuperuar tregon pasurim të suksesshëm.

Validimi Pozitiv i Klonimit

Klonet e vetme izolohen nga eluati përfundimtar nëpërmjet vendosjes në pllaka. Klonet pozitive kërkojnë validim:

Shqyrtimi parësor

96 klone të zgjedhura rastësisht amplifikohen. Lidhja me pllakat e veshura me shënjestër vlerësohet me anë të ELISA-s. Zbulimi përdor antitrupin anti-M13 të konjuguar me HRP; klonet me vlera OD450 që tejkalojnë trefishin e kontrollit negativ konsiderohen pozitive. Një shkallë pozitive >30% tregon një panning efektiv.

Validimi i thelluar

(1) Sekuencim me rendiment të lartë:
ADN-ja nga klonet pozitive sekuencohet. Motivet e konsensusit identifikohen duke përdorur mjete si Clustal Omega.

(2) Matja e afinitetit:
Peptidet pozitive sintetizohen kimikisht. Kinetika e lidhjes (p.sh., Kd, Kon, Koff) përcaktohet duke përdorur teknika si Rezonanca e Plazmoneve Sipërfaqësore (SPR) ose Interferometria e Bio-Shtresës (BLI).

Aplikime Teknologjike

Bibliotekat e peptideve të shfaqjes së fagut ofrojnë vlerë të konsiderueshme në hartëzimin e epitopeve dhe njohjen e synuar.

Shembull i Literaturës së Hartimit të Epitopeve + KMDBioscience

Fig. 2 Shembull i Literaturës për Hartimin e Epitopeve

Për shembull, Xinye Chen et al.[1] përdorën shfaqjen e fagut për të hartëzuar epitopet e qelizave B në proteinën thelbësore të Virusit të Diarresë Virale të Gjedhit (BVDV).

Shembull i Literaturës së Njohjes së Synuar + KMDBioscience

Fig. 3 Shembull i Literaturës së Njohjes së Synuar

Xiaoxu Li et al.[2] përdorën analizën e maturimit të afinitetit të bibliotekave të shfaqjes së fagut për të izoluar peptide me synim të dyfishtë për glioblastomën.

Përmbledhje dhe Perspektivë

Planifikimi dhe zbatimi i kujdesshëm i rrjedhave të punës së ndërtimit dhe shqyrtimit të bibliotekës së shfaqjes së fagëve është thelbësor për zhvillimin e molekulave të synuara.

Aftësitë e platformës sonë përfshijnë:
(i) Sigurimi i bibliotekave të peptideve të gatshme për shqyrtim për përdorim të menjëhershëm.
(ii) Ofrimi i ndërtimit të bibliotekave të personalizuara me diversitet të optimizuar.
(iii) Mundësimi i zbulimit të peptideve me afinitet të lartë për antitrupat, identifikimi i objektivit, kërkimi dhe zhvillimi i vaksinave dhe shqyrtimi i barnave.
(iv) Ofrimi i peptideve specifike për objektivin për të përshpejtuar kërkimin dhe zhvillimin terapeutik.

Alpha Lifetech shfrytëzon teknologjinë e përparuar të bibliotekës së peptideve të shfaqjes së fagut për të ofruar shërbime gjithëpërfshirëse dhe të gjithanshme për ndërtimin dhe shqyrtimin e bibliotekave të ndryshme. Klientët përfitojnë nga bibliotekat e shfaqjes së fagut të personalizueshme duke përdorur vektorë dhe lloje të ndryshme pritëse, duke mundësuar identifikimin e shpejtë të peptideve me afinitet të lartë kundrejt molekulave të tyre të synuara.

Pyetje të shpeshta

1. Si mund të sigurohemi që diversiteti i bibliotekës së peptideve të ndërtuara përmbush pritjet?

Optimizimi i hapave të lidhjes dhe transformimit është thelbësor për të siguruar diversitetin e bibliotekës.

(i) Pastroni me rigorozitet vektorët e linearizuar për të hequr enzimat e mbetura të kufizuesit që mund të pengojnë lidhjen.
(ii) Mbani një raport molar vektor-futje midis 1:3 dhe 1:10 (përcaktoni raportin optimal nëpërmjet eksperimenteve pilot).
(iii) Kryeni lidhjen në 16°C për ≥12 orë.

(iv) Përdorni shtame elektrokompetentë me efikasitet të lartë (p.sh., SS320 ose TG1; efikasitet ≥1010 CFU/μg). Elektroporoni menjëherë pas rikuperimit në banjë akulli duke përdorur parametra 1.8–2.0 kV për 5 ms.
(v) Synoni një bibliotekë me madhësi >109 klone të pavarura.
(vi) Validoni diversitetin duke sekuencuar 20-50 klone të zgjedhura rastësisht; >70% duhet të tregojnë sekuenca unike.
2. Si mund t’i optimizojmë kushtet e elucionit për të zvogëluar lidhjen jospecifike gjatë shqyrtimit?

Minimizoni lidhjen jospecifike përmes larjes së rreptë dhe elucionit të synuar:

(i) Larja: Përdorni tretësirë tampon larjeje (PBS + 0.1% Tween-20). Kryeni 10 larje në Raundin 1; rritni larjet gradualisht në raundet pasuese (p.sh., 20 larje). Për sfond të lartë, merrni në konsideratë shtimin e 0.5 M NaCl ose 1% BSA për të rritur ashpërsinë.
(ii) Elucioni: Preferohet elucioni me gradient pH: Inkubohet me 100 mM glicinë-HCl (pH 2.2) për 10 minuta. Neutralizohet menjëherë me 1 M Tris-HCl (pH 9.0).

Për ligandët me afinitet të lartë: Përdorni elucion konkurrues (inkubim 1-orësh me proteinë të tepërt të synuar). Shmangni copëtimin e proteazës për të parandaluar degradimin e peptideve.
3. Si e vlerësojmë suksesin e shqyrtimit dhe si e zgjidhim problemin e pozitivëve të rremë?

Metrika kryesore e suksesit: Pasurimi i fagut. Llogaritni raportin e pasurimit (fagu dalës kundrejt atij hyrës për raund). Prisni një rritje eksponenciale (p.sh., 100–1000 herë më e lartë në Raundin 3 kundrejt Raundit 1).

Zgjidhja e problemeve me pozitivet e rreme:

(i) Adsorbimi jospecifik i synuar: Bllokojeni me 3% BSA + 1% qumësht të skremuar gjatë veshjes. Para-adsorboni fagun te bartësit e paveshur.
(ii) Ndërhyrja e antitrupave antifagë: Përfshini kontrolle negative të veshura me antitrupa anti-M13. Merrni në konsideratë shqyrtimin në fazën e tretësirës me shënjestra të biotiniluara + sfera streptavidine.
(iii) Validimi: Përfshini gjithmonë kontrollet e paveshura të objektivit në ELISA.
4. Si mund ta parandalojmë rritjen e tepërt të sekuencave dominante gjatë amplifikimit të bibliotekës?

Kontrolloni kushtet e amplifikimit në mënyrë strikte: Shtoni fagun ndihmës në një MOI=20:1 kur kultura pritëse arrin OD600=0.5. Tundeni dhe inkubojeni në 37°C për 1 orë, pastaj kaloni në 30°C për ≤8 orë. Kryeni vetëm një cikël amplifikimi për raund; shmangni >3 pasazhe të njëpasnjëshme.

Pastroni fagun e amplifikuar nëpërmjet reshjes PEG/NaCl: Shtoni 4% PEG-8000 + 0.5 M NaCl. Precipitoni përzierjen në 4°C për 1 orë, centrifugojeni dhe risuspendojeni peletin në PBS për të hequr mbeturinat.
5. Pse klonet pozitive tregojnë sinjale të forta ELISA, por riprodhueshmëri të dobët të sekuencimit?

Tre faktorë teknikë mund të shkaktojnë këtë mospërputhje:

(i) Dizajni i prajmerit: Sekuencat anësore të synuara të MCS të vektorit (p.sh., për vektorin M13KE: 5'-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3').
(ii) Probleme me kodonet e rralla: Kodonet e rralla të E. coli (p.sh., AGG/AGA për Arg) mund të shkaktojnë përkthim të cunguar. Optimizoni përdorimin e kodonit peptidik ose kaloni në llojet pritëse të serisë Rosetta.
(iii) Motive strukturore të konservuara: Sekuencat e dallueshme mund të ndajnë motive funksionale (p.sh., mbetje të ngarkuara me modele). Kryeni rreshtimin me shumë sekuenca për të identifikuar vendet kryesore të konservuara.

referencë

[1] Xinye C, Xiuyan D, Liqian Z, etj. Identifikimi i një epitopi të qelizave B në proteinën thelbësore të virusit të diarresë virale të gjedhit (BVDV) bazuar në një mimotop të marrë nga një bibliotekë peptidesh e shfaqur në fag [J]. Revista Ndërkombëtare e Makromolekulave Biologjike, Vëllimi 183, 2021, Faqet 2376-2386.

[2] Xiaoxu L, Ximing P, Xingming W, etj. Një peptid me dy synime për glioblastomën i shqyrtuar nga biopanifikimi i bibliotekës së peptideve të shfaqjes së fagut i kombinuar me analizën e afinitetit-përshtatshmërisë [J]. Revista Ndërkombëtare e Farmaceutikës, Vëllimi 644, 2023, 123306.

Protokolli i Shqyrtimit të Bibliotekës së Peptideve të Shfaqjes së Fagut dhe Pyetjet e Shpeshta