Protokolli i tërheqjes poshtë dhe pyetjet e shpeshta

Teknika Pull-Down u prezantua për herë të parë nga Harlow dhe Lane në librin e tyre të vitit 1999 "Përdorimi i Antitrupave: Një Manual Laboratori". Ky libër përshkruan në detaje zbatimin e antitrupave në eksperimentet e biokimisë dhe biologjisë qelizore, dhe ofron një bazë për projektimin eksperimental, optimizimin dhe analizën e rezultateve të teknikës Pull-Down. Më pas, teknologjia Pull-Down është bërë gradualisht një nga mjetet e rëndësishme për të studiuar funksionin e proteinave dhe ndërveprimet molekulare, veçanërisht në kërkimin e ndërveprimit proteinë-proteinë (PPI). Teknologjia moderne Pull-Down nuk është e kufizuar vetëm në metodat tradicionale të pastrimit të afinitetit, por ka zhvilluar edhe një sërë variantesh, të tilla si GST Pull-Down, His-tag Pull-Down, Biotin-Streptavidin Pull-Down dhe bashkë-imunoprecipitimi i bazuar në sfera magnetike (Co-IP), i cili ka luajtur një rol gjithnjë e më të rëndësishëm në proteomikë, transduksion të sinjalit dhe kërkimin e modifikimit të proteinave.

Parimi i tërheqjes poshtë

Analiza tërheqëse është një teknikë biokimike e bazuar në pastrimin e afinitetit, e cila përdoret për të studiuar bashkëveprimin midis proteinës-proteinës, proteinës-acidit nukleik ose biomolekulave të tjera. Parimi kryesor është përdorimi i lidhjes specifike midis një proteine të njohur 'karrem' dhe një proteine të mundshme 'pre' për të ndarë kompleksin lidhës nga mbështetësja e fazës së ngurtë për të verifikuar ekzistencën e bashkëveprimit dhe analiza të mëtejshme.

Proteinat e karremit dhe proteinat e karremit të etiketuar

Zakonisht proteina të njohura si shënjestër, studiuesit shpresojnë t'i përdorin ato për të kapur proteinat që bashkëveprojnë me to. Për të lehtësuar pastrimin dhe zbulimin, proteinat karrem zakonisht etiketohen me një etiketë specifike (si GST, His, FLAG, etj.). Këto etiketa mund të lidhen posaçërisht me ligandët në mbështetësen e ngurtë.

1Etiketa GST: Lidhja me sferat e glutation agarozës.
2 Etiketa e tij: Lidhja me rrëshirën kelatuese të joneve të nikelit ose kobaltit.
3 Etiketa FLAG: sfera të lidhura me antitrupin anti-FLAG.

Mbështetësit e fazës së ngurtë (siç janë sferat e agarozës, sferat magnetike, etj.) janë mjete kyçe për eksperimentet Pull-down. Sipërfaqja e tyre modifikohet me një ligand specifik, i cili mund të lidhet posaçërisht me etiketën e proteinës karrem. Për shembull, sferat e agarozës glutation përdoren për të lidhur proteinat e etiketuara me GST; rrëshira nikel-NTA u përdor për të lidhur proteinën e etiketuar me His.

Kombinim dhe Kapje

Proteina e karremit me etiketën u inkubua me mbështetësen e fazës së ngurtë për ta lidhur proteinën e karremit me mbështetësen e fazës së ngurtë përmes etiketës. Proteinat e mundshme ndërvepruese (proteinat e presë, Preja) shtohen në sistem. Proteinat e presë mund të jenë lizate qelizore, proteina të pastruara ose mostra të tjera biologjike. Nëse proteinat e presë bashkëveprojnë me proteinat e karremit, ato formojnë komplekse dhe imobilizohen në mbështetëse të ngurta.

Lani

Pas inkubimit, proteinat e palidhura dhe proteinat jo-specifike duhet të hiqen me anë të hapave të larjes. Tamponët e larjes zakonisht përmbajnë një përqendrim të caktuar të kripërave (siç është NaCl) dhe detergjentëve (siç është Triton X-100) për të zvogëluar lidhjen jo-specifike. Hapi i larjes është çelësi i eksperimentit Pull-down, i cili përcakton specifikën dhe raportin sinjal-zhurmë të eksperimentit.

Elucion

Kompleksi i proteinave të lidhura duhet të çlirohet nga mbështetësja e ngurtë me anë të tamponit të elucionit. Metoda e elucionit varet nga karakteristikat e etiketës dhe mbështetëses së ngurtë:

1Elucion konkurrues: për shembull, proteinat e etiketuara me GST eluohen me përqendrime të larta të glutationit.
2 Ndryshimet në pH ose forcën jonike: Për shembull, proteinat e etiketuara me His eluohen me tampona me pH të ulët ose përqendrime të larta të imidazolit.
3 Elucioni me copëtim: Nëse etiketa përmban një vend copëtimi (siç është një vend i proteazës TEV), proteina e synuar mund të çlirohet me anë të copëtimit.

Zbulimi dhe Analiza

1SDS-PAGE: Proteina e eluuar u nda me anë të elektroforezës SDS-PAGE.
2 Western blot: Proteinat e synuara ose proteinat ndërvepruese u zbuluan duke përdorur antitrupa specifikë.
3 Analiza e spektrometrisë së masës: Nëse duhet të identifikohen proteina të panjohura ndërvepruese, proteinat e eluuara mund të analizohen me anë të spektrometrisë së masës.

Hapat e tërheqjes poshtë

Përgatitja e proteinës karrem

Proteina e karremit shpesh modifikohet gjenetikisht për të përfshirë një etiketë specifike (p.sh., GST, His, FLAG) që lejon identifikimin dhe pastrimin e lehtë. Etiketa siguron që proteina e karremit të mund të kapet lehtësisht gjatë procesit të tërheqjes. Karremi zakonisht shprehet dhe pastrohet nga një sistem rekombinant, siç janë bakteret ose qelizat e gjitarëve, për të siguruar një rendiment të lartë të proteinave funksionale.

Lidhja me proteinat e presë

Pasi proteina e karremit përgatitet, ajo inkubohet me një lizat qelizor ose indi në kushte të kontrolluara. Lizati përmban një përzierje komplekse proteinash, dhe proteina e karremit do të bashkëveprojë në mënyrë specifike me proteinat e saj partnere, të njohura si preja. Ky lidhje mund të lehtësohet nga faktorë si temperatura, pH dhe forca jonike, të cilat janë të optimizuara për bashkëveprimin midis proteinave të karremit dhe presë. Gjatë këtij hapi, ndodhin bashkëveprime proteinë-proteinë kalimtare ose të qëndrueshme, duke lejuar që proteinat e presë të lidhen me karremin.

Kap

Pas periudhës së inkubacionit, proteina e karremit dhe proteinat e presë me të cilat ndërveprojnë duhet të izolohen nga pjesa tjetër e përzierjes. Kjo arrihet duke përdorur një antitrup ose ligand specifik që njeh etiketën në proteinën e karremit ose lidhet drejtpërdrejt me vetë karremin. Proteina e karremit, së bashku me çdo proteinë të lidhur të presë, kapet më pas duke përdorur teknika si rruaza afiniteti, të cilat mund të mbulohen me antitrupin ose ligandin. Ky hap i "tërheqjes poshtë" izolon në mënyrë selektive kompleksin e interesit nga tretësira, ndërsa proteinat e palidhura mbeten pas.

Larje

Për të siguruar që të ruhen vetëm ndërveprimet specifike proteinë-proteinë, kompleksi i kapur i nënshtrohet hapave të larjes. Këto larje heqin çdo lidhje jospecifike, duke siguruar që të mbeten vetëm ndërveprimet midis karremit dhe proteinave të vërteta të presë. Kushtet e larjes, duke përfshirë përbërjen dhe forcën e tamponit, janë optimizuar me kujdes për të hequr ndotësit duke ruajtur ndërveprimet specifike.

Elucion

Në këtë hap, proteinat bashkëvepruese shkëputen nga materiali i kapjes (rruaza ose antitrupa) që do të analizohet. Eluimi zakonisht përfshin shtimin e një agjenti konkurrues, siç është peptidi i lirë, imidazoli (për proteinat e etiketuara me His), ose një ndryshim në pH ose përqendrimin e kripës, i cili prish bashkëveprimin midis karremit dhe materialit të kapjes. Ky hap rezulton në çlirimin e komplekseve karrem-pre, të cilat tani janë në një formë të tretshme dhe gati për analiza të mëtejshme.

Analiza

Së fundmi, komplekset e proteinave të eluuara analizohen për të identifikuar proteinat që bashkëveprojnë. Teknikat e zakonshme analitike përfshijnë Western blotting, ku proteinat e karremit dhe të presë zbulohen duke përdorur antitrupa specifikë, dhe spektrometrinë masive, e cila ofron një analizë të detajuar të përbërjes së proteinave. Përveç kësaj, analizat enzimatike mund të kryhen nëse aktiviteti funksional i kompleksit të proteinave është me interes. Këto metoda ndihmojnë në karakterizimin e natyrës së bashkëveprimit proteinë-proteinë, duke ofruar njohuri mbi rrugët ose proceset biologjike në të cilat mund të përfshihen proteinat.

Pikat kryesore të eksperimentit Pull-down

1Përzgjedhja e proteinave të karremit: Sigurohuni që proteina e karremit të jetë aktive dhe etiketa të mos ndikojë në funksionin e saj.
2 Optimizimi i kushteve të larjes: Lidhja jo-specifike u zvogëlua duke rregulluar përbërjen e tamponit të larjes dhe numrin e larjeve.
3Eksperimenti i kontrollit: u vendosën kontroll negativ (si p.sh. mungesë proteine karrem) dhe kontroll pozitiv (si p.sh. çifte të njohura të proteinave të ndërveprimit) për të siguruar besueshmërinë e eksperimentit.

Materiale eksperimentale

1 Proteinat e synuara: zakonisht proteina rekombinante me etiketa (si GST, His, FLAG, etj.).
2 Proteinat e mundshme ndërvepruese: mund të jenë lizate qelizore, proteina të pastruara ose mostra të tjera biologjike.
3 Mbështetës i fazës së ngurtë: siç janë sferat e agarozës, sferat magnetike, etj.
4 Tamponi lidhës: zakonisht përmban Tris-HCl, NaCl, MgCl2, DTT, etj.
5 Tamponi larës: përdoret për të hequr proteinat e palidhura.
6 Tamponi i elucionit: përdoret për të eluuar proteinën e lidhur nga mbështetësi i ngurtë.
7 Reagenti SDS-PAGE: për ndarjen e proteinave.
8 Reagenti Western blot: përdoret për të zbuluar proteinën e synuar.
9 Antitrupat: antitrupa specifikë kundër proteinave ose etiketave të synuara.

Figura 1. Rrjedha e punës së etiketimit të fotoafinitetit me metodën zbritëse me BSA dhe Probe. (Burimi i referencës: Provë e konceptit: Analizë tërheqëse poshtë duke përdorur albuminën e serumit të gjedhit dhe një molekulë të vogël imunomodulator.）

Lloji i eksperimentit "Tërheqje poshtë"

Sipas qëllimit dhe dizajnit të eksperimentit, eksperimenti Pull-down mund të ndahet në llojet e mëposhtme:

Zbritje GST

Proteina karrem e etiketuar me GST lidhet me sferat e glutation agarozës. Është e përshtatshme për pastrim në shkallë të gjerë dhe zbulim të ndërveprimeve të proteinave.

Tërheqja e tij poshtë

Proteina karrem e etiketuar me His lidhet me rrëshirën kelatuese të joneve të nikelit ose kobaltit. Është e përshtatshme për eksperimente në shkallë të vogël dhe shqyrtime me rendiment të lartë.

aplikimi i Pull-Down

Verifikoni Ndërveprimet e Njohura

Eksperimentet tërheqëse u kryen për të verifikuar nëse kishte një bashkëveprim të drejtpërdrejtë midis dy proteinave.

Shqyrtimi i proteinave ndërvepruese

Proteinat e panjohura që bashkëveprojnë me proteinën e synuar u shqyrtuan nga lizat qelizor.

Studim mbi Mekanizmin e Ndërveprimit

Rajonet kryesore të ndërveprimit u studiuan nga mutantët ose cungimet.

Shqyrtimi i drogës

Për të studiuar efektin e barnave me molekula të vogla në bashkëveprimin e proteinave.

Pyetje të shpeshta

1. Avantazhet e eksperimentit Pull-down

(1) Specifikitet i lartë: Proteina e synuar dhe proteinat e saj bashkëvepruese mund të kapen në mënyrë efikase nga lidhja specifike e etiketës dhe mbështetëses së ngurtë. (2) Fleksibilitet i lartë: Mund të përdoret për të studiuar shumë lloje të bashkëveprimeve molekulare (siç janë proteinë-proteinë, proteinë-acid nukleik). (3) Diapazon i gjerë aplikimi: i përshtatshëm për tampon lize qelizore, proteinë të pastruar, sistem përkthimi in vitro dhe mostra të tjera.
2. Si të zgjidhni temperaturën dhe kohën e eksperimentit me zbritje të GST-së?

Temperatura e eksperimentit me ulje të GST-së është zakonisht 4 °C dhe koha është 2-4 orë. Mund të rregullohet sipas mostrave të ndryshme.
3. Çfarë duhet t'i kushtohet vëmendje kur kryhet Pull-Down në lizatin qelizor?

Sigurohuni që kushtet e lizatit qelizor (p.sh., pH, përqendrimi i kripës) janë të favorshme për proteinën e synuar dhe partnerin bashkëveprues. Duke përdorur tampon të freskët të lizës, mund të shtohen frenues të proteazës për të shmangur degradimin e proteinave.
4. Precipitati nuk e përmban plotësisht proteinën ose kompleksin e synuar.

(1) Larje e tepërt: Larja e tepërt mund të largojë proteinën e synuar. Zvogëloni numrin e herëve të larjes për t'u siguruar që kompleksi të mos hollohet tepër. (2) Përqendrim jo i duhur i kripës: Disa bashkëveprime proteinë-proteinë nuk mund të formohen në kushte të larta kripe, prandaj përpiquni të rregulloni përqendrimin e kripës së tretësirës së larjes.
5. Çfarë lloj mostre është e përshtatshme për eksperimentin Pull-Down?

(1) Mostrat e proteinave: Proteinat e pastruara të nxjerra nga lizatet qelizore, ose proteinat e synuara të shprehura me anë të transfektimit. (2) Mostrat e qelizave: Lizatet e të gjithë qelizave të nxjerra nga kultura qelizore janë të përshtatshme për të gjetur partnerë ndërveprues për proteina specifike. (3) Mostrat e indeve: Indet nxirren nga minjtë ose modele të tjera dhe lizohen me metoda të veçanta trajtimi (siç është sonifikimi), të përshtatshme për të studiuar ndërveprimin e proteinave specifike në inde. (4) Kompleks specifik: Nëse proteina e synuar është pjesë e një kompleksi, ajo mund të analizohet duke tërhequr poshtë të gjithë kompleksin dhe duke u ndarë dhe pasuruar duke përdorur ligandë ose etiketa të njohura. (5) Molekulë e vogël ose sondë kimike: Në disa raste, proteina e synuar që lidhet me molekula të vogla ose sonda kimike mund të përdoret për eksperimente Pull-Down.

referencë

[1] Louche A, Salcedo SP, Bigot S. Ndërveprimet Proteinë-Proteinë: Analiza tërheqëse. Metodat Mol Biol. 2017;1615:247-255. doi:10.1007/978-1-4939-7033-9_20

[2] Lyu S, Zhang C, Hou X, Wang A. Analiza tërheqëse e bazuar në etiketë. Metodat Mol Biol. 2022;2400:105-114. doi:10.1007/978-1-0716-1835-6_11

[3] Einarson MB, Pugacheva EN, Orlinick JR. Tërheqja e GST-së. CSH Protoc. 2007; 2007: pdb.prot4757. Publikuar 1 gusht 2007. doi:10.1101/pdb.prot4757

[4] Gnanasekaran P, Pappu HR. Zbulimi i Ndërveprimeve Proteinë-Proteinë Duke Përdorur Teknikën e Analizës Pull-Down të Glutation-S-Transferazës (GST). Methods Mol Biol. 2023;2690:111-115. doi:10.1007/978-1-0716-3327-4_10

[5] Kim SY, Hakoshima T. Analiza GST Pull-Down për të matur formacionet komplekse. Metodat Mol Biol. 2019;1893:273-280. doi:10.1007/978-1-4939-8910-2_20