Protokolli i Prodhimit të Proteinave Rekombinante dhe Pyetjet e Shpeshta

Prodhimi i Proteinave Rekombinante është një proces i shprehjes së gjeneve të huaja dhe prodhimit të proteinave të synuara në qelizat pritëse me anë të inxhinierisë gjenetike. Kjo teknologji zakonisht përdoret për të përgatitur proteina që janë të vështira për t'u marrë ose nuk mund të prodhohen në mënyrë efektive në gjendjen natyrore, siç janë proteina të ndryshme për aplikime mjekësore, shkencore, industriale dhe bioteknologjike.

Parimi i Prodhimit të Proteinave Rekombinante

Bazuar në teknologjinë e inxhinierisë gjenetike, gjenet ekzogjene shprehen dhe proteinat shënjestër prodhohen duke përdorur mekanizmat e transkriptimit dhe përkthimit të qelizave pritëse. Procesi kryesor është futja e një gjeni që kodon një proteinë specifike (zakonisht një gjen të huaj) në qelizën pritëse dhe prodhimi i proteinës shënjestër përmes procesit natyror të biosintezës së qelizës.

Hapat e Prodhimit të Proteinave Rekombinante

Hapat eksperimentalë të prodhimit të proteinave rekombinante zakonisht përfshijnë hapat kryesorë si më poshtë. Përfundimi me sukses i secilit hap është thelbësor për proteinën rekombinante përfundimtare me cilësi të lartë:

Klonimi i Gjeneve dhe Ndërtimi i Vektorëve

Përzgjedhja dhe nxjerrja e gjeneve të synuara

Gjenet koduese të proteinave të synuara u nxorën nga organizmat burimorë (si njerëzit, bakteret, bimët, etj.). Gjeni i synuar shpesh amplifikohet nga PCR (reaksion zinxhir polimerazë).

Futja e një vektori shprehjeje

Gjeni i synuar klonohet në një vektor shprehjeje (siç është një plazmid). Vektorët e shprehjes zakonisht përmbajnë promotorë, sekuenca etiketash, shënjues të përzgjedhshëm, etj., të cilët mund të nxisin shprehjen e gjeneve të huaja në qelizat pritëse.

Verifikimi i vektorit

Vektori i ndërtuar u tret dhe u sekuencua për të siguruar që gjeni i synuar ishte futur saktë në vektor.

Përzgjedhja e qelizave pritëse të përshtatshme

Sipas natyrës së proteinës së synuar dhe nevojave të prodhimit, zgjidhni qelizat pritëse të përshtatshme. Pritësit e zakonshëm përfshijnë:

1Escherichia coli (E.coli): i përshtatshëm për prodhimin e proteinave të thjeshta dhe kosto të ulëta prodhimi.
2 Maja, qelizat e insekteve, qelizat e gjitarëve: të përshtatshme për prodhimin e proteinave komplekse, siç janë proteinat që kërkojnë glikozilim, palosje dhe modifikim kompleks.

Transformimi/Transfektimi i qelizave pritëse

Zgjidhni qelizat pritëse të përshtatshme

Zgjidhni qelizat pritëse sipas karakteristikave të proteinës së synuar. Qelizat pritëse të përdorura zakonisht përfshijnë Escherichia coli (E.coli), maja, qelizat e insekteve, qelizat e gjitarëve, etj.

Transformimi prokariotik (për pritësit prokariotikë si E.coli)

Vektorët e shprehjes futen në qelizat pritëse me anë të shokut të nxehtësisë, transformimit kimik ose elektroporimit.

Transfektimi (për strehuesit eukariotikë, siç janë qelizat e gjitarëve)

Vektori futet në qelizat pritëse duke përdorur reagentë kimikë (si lipozome) ose teknika të elektroporimit.

Shqyrtimi i qelizave të transformuara/transfektuara

Qelizat e transformuara ose transfektuara me sukses u përzgjodhën me anë të shqyrtimit me antibiotikë (siç është përdorimi i gjeneve të rezistencës ndaj antibiotikëve të përfshira në vektor).

Shprehja e proteinave

Shprehje e induktuar

Nëse qeliza pritëse e përdorur ka një sistem shprehjeje të kontrollueshëm (siç është sistemi T7 në E.coli), shprehja e proteinës së synuar aktivizohet duke shtuar induktorë (siç është IPTG).

Optimizimi i kushteve të shprehjes

Niveli i shprehjes dhe gjendja e palosjes së proteinës së synuar u optimizuan duke rregulluar temperaturën e kulturës, përbërjen e mediumit, kohën e induksionit dhe kushte të tjera.

Kontroll i shprehjeve

SDS-PAGE, Western blot dhe metoda të tjera u përdorën për të kontrolluar paraprakisht shprehjen e proteinës së synuar për të siguruar sasinë dhe cilësinë e shprehjes së saj.

Mbledhja dhe liza e qelizave

Mbledhja e qelizave

Qelizat pritëse ndahen nga mediumi i kulturës me anë të centrifugimit dhe zakonisht ngrihen ose përdoren direkt për lizë.

Liza e qelizave

Qelizat u shkatërruan me metoda fizike (të tilla si shkatërrimi me ultratinguj, homogjenizimi me presion të lartë) ose metoda kimike (të tilla si tamponi i lizës, liaza, etj.) për të çliruar proteinat e përmbajtura.

Kontrolloni efektin e lizës

Tretësira e lizës u analizua me SDS-PAGE për të konfirmuar çlirimin e proteinës.

Pastrimi i proteinave

Pastrimi paraprak

Zgjidhni metodën e duhur të pastrimit sipas karakteristikave të proteinës së synuar. Teknologjitë e përdorura zakonisht përfshijnë:

1Kromatografia e Afinitetit: Pastrim selektiv i proteinës së synuar duke lidhur etiketën e afinitetit (siç është etiketa His) në kolonën e afinitetit.
2 Kromatografia e Shkëmbimit Jonik: Proteinat e ndryshme ndahen sipas karakteristikave të ngarkesës së proteinës.
3 Kromatografia e Filtrimit me Xhel: Ndarja bazuar në peshën molekulare të proteinës.

Verifikimi pas pastrimit

SDS-PAGE, Western blotting dhe teknika të tjera u përdorën për të konfirmuar pastërtinë dhe peshën molekulare të proteinës së synuar.

Verifikimi dhe Karakterizimi i Aktivitetit të Proteinave

Verifikimi funksional

U përdorën metoda biologjike për të verifikuar nëse proteina ka aktivitetin biologjik të pritur. Për shembull, analiza e aktivitetit enzimatik, analiza e lidhjes së antitrupave, etj.

Karakterizimi strukturor

Struktura e proteinës u analizua më tej me anë të spektrometrisë masive, rezonancës magnetike bërthamore (NMR) ose kristalografisë me rreze X.

Vlerësimi i stabilitetit të proteinave

Stabiliteti i proteinës u vlerësua nga stabiliteti termik, stabiliteti i pH-it dhe eksperimente të tjera.

Ruajtja dhe Aplikimi i Proteinave

Kushtet e ruajtjes

Sipas karakteristikave të proteinës, zgjidhni kushtet e përshtatshme të ruajtjes (si krioprezervimi, tharja me ngrirje, etj.) për të siguruar stabilitetin e proteinës.

Aplikacioni

Proteina rekombinante e pastruar mund të përdoret për aplikime të ndryshme, të tilla si kërkime shkencore, zhvillim vaksinash, aplikime enzimatike, prodhim ilaçesh, etj.

Figura 1. Vektorët bazë të shprehjes për shprehje me rendiment të lartë në E. coli të (a) proteinave citoplazmike dhe (b) proteinave të membranës. (Burimi i referencës: Shprehja e proteinave rekombinante me rendiment të lartë në Escherichia coli: statusi aktual dhe perspektivat e ardhshme.）

Alpha Lifetech ofron shërbime të Prodhimit të Proteinave Rekombinante, duke u ofruar klientëve zgjidhje të prodhimit të proteinave rekombinante me cilësi të lartë, duke mbuluar të gjithë procesin nga klonimi i gjeneve, përzgjedhja e sistemit të shprehjes deri te pastrimi i proteinave dhe kontrolli i cilësisë. Ne jemi të përkushtuar të ofrojmë shërbime të personalizuara të proteinave rekombinante për biofarmaceutikët, institucionet kërkimore shkencore dhe kompanitë farmaceutike për të përmbushur nevojat e klientëve në faza të ndryshme të kërkimit.

Pyetje të shpeshta

1. Shprehje e ulët e proteinës rekombinante.

Shkaku: sistemi i shprehjes së proteinave (si Escherichia coli, maja, qelizat e insekteve, etj.) përzgjedhje e papërshtatshme. Rregullim i papërshtatshëm i shprehjes së gjenit ekzogjen (p.sh. përzgjedhja e papërshtatshme e promotorit). Proteina e synuar mund të jetë toksike dhe të pengojë rritjen e qelizave pritëse. Mutacionet ose modifikimet post-përkthyese të sekuencës së gjenit ndikojnë në shprehje. Zgjidhja: Zgjedhja e një sistemi shprehjeje më të përshtatshëm, siç janë sistemet e qelizave të insekteve, është zakonisht më e mirë për shprehjen e proteinave komplekse eukariote. Përdorni promotorë më të fortë ose më të përshtatshëm për të optimizuar gjenet koduese. Kultura në temperaturë të ulët (si 16℃) u përdor për të zvogëluar toksicitetin dhe për të përmirësuar palosjen e proteinave. Analiza e mutacionit ose optimizimi i etiketave të gjeneve.
2. Proteina dështoi të paloset siç duhet, duke rezultuar në formimin e trupave përfshirës.

Shkaku: mbishprehja e proteinave, duke rezultuar në mekanizmin e palosjes që nuk mund të vazhdojë. Sistemi i shprehjes nuk mbështet palosjen e saktë të proteinës së synuar. Struktura e proteinës është komplekse dhe kërkon shoqërues molekularë ndihmës për të ndihmuar palosjen. Zgjidhja: Temperatura më e ulët e shprehjes (p.sh. 16℃ ose më e ulët) ngadalëson shkallën e sintezës së proteinave dhe rrit probabilitetin e palosjes së saktë. Bashkëshprehja e shoqëruesve molekularë (si GroEL / GroES) ose faktorëve të palosjes ndihmon proteinat të palosen saktë. Zgjidhni sistemin e duhur të shprehjes, siç është shprehja në qelizat e insekteve ose qelizat e gjitarëve. Modifikues kimikë ose aditivë të mediumit u përdorën për të nxitur palosjen.
3. Vështirësi në pastrimin e proteinave.

Shkaku: Proteina e synuar është e patretshme ose pak hidrofile, duke e bërë të vështirë nxjerrjen e saj. Proteinat kanë veti fizike dhe kimike të ngjashme me proteinat pritëse dhe janë të vështira për t'u ndarë. Humbja është serioze në procesin e pastrimit. Zgjidhja: Përmirësoni specifikën dhe efikasitetin e pastrimit me anë të metodave të pastrimit të etiketës (si etiketa His, etiketa GST). Përqendrimi i tamponit dhe kripës u optimizuan për të siguruar stabilitetin e proteinës në tretësirë. U përdor një kombinim i kromatografisë së afinitetit, kromatografisë së shkëmbimit jonik, filtrimit të xhelit dhe metodave të tjera të pastrimit.
4. Degradimi ose inaktivizimi i proteinave.

Shkaku: Proteina e synuar degradohet nga enzimat brenda qelizës ose gjatë procesit të pastrimit. Proteinat janë të paqëndrueshme në tretësirë. Zgjidhja: Shtoni frenues të proteazës për të parandaluar degradimin. Rregulloni temperaturën, pH-in dhe forcën jonike gjatë procesit të pastrimit për të shmangur degradimin e proteinave. Optimizoni stabilitetin e proteinës së synuar (si p.sh. duke bashkuar etiketat ose duke shtuar stabilizues) - Ruani proteinat në 80 ℃ për të parandaluar denatyrimin.
5. Proteina nuk ka aktivitet biologjik.

Shkaku: palosja e proteinave nuk është e plotë, e paaftë për të formuar strukturë aktive. Mungesë e modifikimeve të nevojshme post-përkthyese (si fosforilimi, glikozilimi). Proteina e synuar kërkon një strukturë dimere ose multimere për të qenë aktive. Zgjidhja: Optimizoni kushtet e palosjes së proteinave për të siguruar që ajo të ketë një konformacion aktiv. Modifikimet post-përkthyese kryhen në sisteme të përshtatshme shprehjeje, siç është shprehja në qelizat e gjitarëve për të siguruar glikozilimin. Për të shqyrtuar dhe rregulluar konformacionin e një proteine, duke përdorur kofaktorë të përshtatshëm ose modifikime kimike.

referencë

[1] Ferrer-Miralles N, Saccardo P, Corchero JL, Xu Z, García-Fruitós E. Hyrje e përgjithshme: prodhimi i proteinave rekombinante dhe pastrimi i proteinave të patretshme. Metodat Mol Biol. 2015; 1258: 1-24. doi: 10.1007/978-1-4939-2205-5_1

[2] Kosobokova EN, Skrypnik KA, Kosorukov VS. Përmbledhje e Etiketave të Bashkimit për Proteinat Rekombinante. Biokimi (Mosc). 2016;81(3):187-200. doi:10.1134/S0006297916030019

[3] Hayat SMG, Farahani N, Golichenari B, Sahebkar A. Shprehja e proteinave rekombinante në Escherichia coli (E.coli): Çfarë duhet të dimë. Curr Pharm Des. 2018;24(6):718-725. doi:10.2174/1381612824666180131121940

[4] Jia B, Jeon CO. Shprehja e proteinave rekombinante me rendiment të lartë në Escherichia coli: statusi aktual dhe perspektivat e ardhshme. Open Biol. 2016;6(8):160196. doi:10.1098/rsob.160196

[5] Jenkins N, Meleady P, Tyther R, Murphy L. Strategji për analizimin dhe përmirësimin e shprehjes dhe cilësisë së proteinave rekombinante të prodhuara në qelizat e gjitarëve. Biotechnol Appl Biochem. 2009;53(Pjesa 2):73-83. Botuar më 6 maj 2009. doi:10.1042/BA20080258

[6] Wingfield PT. Përmbledhje e pastrimit të proteinave rekombinante. Curr Protoc Protein Sci. 2015;80:6.1.1-6.1.35. Botuar më 1 Prill 2015. doi:10.1002/0471140864.ps0601s80

[7] Oliveira C, Domingues L. Udhëzime për të arritur proteina rekombinante të pastruara me cilësi të lartë. Appl Microbiol Biotechnol. 2018;102(1):81-92. doi:10.1007/s00253-017-8623-8