Platforma e Renditjes së Qelizave të Vetme B

Antitrupat monoklonalë (mAb) si pionier i barnave me antitrupa, më shumë se 100 antitrupa monoklonalë janë miratuar për trajtimin e kancerit, sëmundjeve infektive, tregun e zhvillimit të barnave dhe tregojnë vlerën e tyre unike terapeutike. Teknologjia e antitrupave të qelizave B të vetme, si një brez i ri i teknologjisë së zhvillimit të antitrupave, mund të izolojë në mënyrë efikase dhe të shpejtë antitrupat nga qelizat B të vetme, gjë që është një përparim në teknologjinë e prodhimit të antitrupave pas hibridomës dhe shfaqjes së fagut. Teknologjia e klasifikimit të qelizave B të vetme mund të përdoret për të gjeneruar antitrupa kundër specieve të shumta si lepujt, minjtë, devetë, delet dhe pulat. Teknologjia e qelizave B të vetme ka avantazhe të jashtëzakonshme si specifikë e lartë, aktivitet i lartë dhe afinitet i lartë. Bazuar në platformën e klasifikimit të qelizave B të vetme, Alpha Lifetech ka avantazhe në kohën e shqyrtimit dhe marrjen e antitrupave me cilësi të lartë. Mund të ofrojë dizajn, sintezë dhe modifikim të antigjenit, imunitet të kafshëve, shqyrtim të pasurimit të qelizave B të vetme, sekuencim të qelizave të vetme, shqyrtim me rendiment të lartë, shprehje dhe pastrim, shërbime teknike me një ndalesë të vetme si verifikimi funksional për të përmbushur nevojat e larmishme të klientëve.

Përmbledhje e teknikave të shqyrtimit të qelizave B të vetme

Metodat e shqyrtimit të qelizave B të vetme ndahen kryesisht në metodën e izolimit të rastësishëm dhe izolimin antigjenselektiv. Ndarja e rastësishme është e zbatueshme për mostrat me përqendrim të lartë të izolimit antigjenselektiv, dhe vetëm qelizat B ndahen. Është e thjeshtë për t'u përdorur, por kërkon shumë punë dhe shpesh përdoret si hapi i parë i ndarjes specifike të antigjenit. Metoda e ndarjes specifike të antigjenit është e përshtatshme për situatën kur përmbajtja e antitrupave specifikë, siç janë antitrupat antitumorë dhe antitrupat autoimunë, është e ulët. Është relativisht komplekse të izolohen qelizat B specifike duke përdorur parimin imunologjik të lidhjes specifike të antigjenit dhe antitrupit me origjinalin. Metoda e klasifikimit e përdorur zakonisht dhe avantazhet dhe disavantazhet e saj janë paraqitur në tabelë.

	Qasjet	Avantazhet	Disavantazhet
Rastësor Izolim	Mikromanipulim	Kërkesa të ulëta për pajisje Funksionim i thjeshtë	Efikasitet i ulët Lloje të kufizuara të qelizave të izoluara
	Mikrodiseksioni me kapje lazeri	Saktësi e lartë pozicioni Funksionim i thjeshtë Zgjidhni vizualisht qeliza të ngjashme nga mostra dhe hiqni papastërtitë	Procesi i ndërlikuar i përgatitjes së mostrës Pamundësia për të automatizuar
	Renditja e qelizave të aktivizuara me fluoreshencë	Saktësi dhe efikasitet i lartë Shkallë e lartë automatizimi Zbatim i gjerë	Operacion i ndërlikuar Kërkesa të larta për pajisje
Izolimi Selektiv i Antigjenit	Antigjene të etiketuara me fluorokrom nëpërmjet shumëparametrave	Saktësi dhe efikasitet i lartë Shkallë e lartë automatizimi Rendiment i lartë dhe shumëparametërsh Aftësia për të izoluar qelizat B në faza të ndryshme	Operacion i ndërlikuar Kërkesa të larta për pajisje
	Rruaza magnetike të veshura me antigjen	Funksionim i thjeshtë Përsëritshmëri e lartë Mund të pasurojë qelizat B të synuara	Operacion i ndërlikuar Rruazat magnetike ndikojnë në aktivitetin biologjik të qelizave dhe nuk janë të favorshme për kulturën dhe funksionimin pas izolimit.
	Mikrogdhendje	Efikasitet i lartë Shpejtësi e lartë	Kërkesa të larta për pajisje Efikasitet i ulët
	Analiza e vargut imunospot në një çip	Shkallë e lartë automatizimi Saktësi dhe efikasitet i lartë	Operacion i ndërlikuar Kosto e lartë

Procesi i Shërbimit të Shqyrtimit të Antitrupave të Qelizave të Veçanta B

Imunizimi i kafshëve

Zgjidhni antigjenin e duhur për kafshët eksperimentale (si minjtë, lepujt, etj.) për stimulim imunitar, në mënyrë që ato të mund të prodhojnë antitrupa specifikë kundër antigjenit.

Imunizimi i kafshëve është faza fillestare e gjenerimit të antitrupave. Imunizimi i kafshëve është përdorimi i mekanizmit të përgjigjes imunitare humorale të vetë organizmit, nëpërmjet stimulimit të vazhdueshëm të antigjeneve, kafshët prodhojnë një përgjigje të fortë imunitare dhe më pas sekretojnë antitrupa specifikë kundër antigjeneve specifike.

Mbledhja dhe pasurimi i qelizave B

Limfocitet B u izoluan nga gjaku periferik, shpretka ose nyjet limfatike të kafshëve imune. Këto limfocite B janë stimuluar imunologjikisht për të prodhuar antitrupa kundër antigjeneve specifike.

Me anë të metodave fizike ose kimike (si centrifugimi me gradient dendësie, ndarja e sferave magnetike, etj.), pasurimi i qelizave B, heqja e papastërtive qelizore përmirëson pastërtinë e qelizave B dhe efikasitetin e ndarjes pasuese.

Fig. 1 Klonimi dhe përgatitja e antitrupave monoklonalë të lepurit. Burimi i referencës:Klonimi i qelizave të vetme B dhe prodhimi i antitrupave monoklonalë të lepurit.)

Renditja e qelizave B

Renditja e Qelizave të Aktivizuara me Fluoreshencë (FACS), Ndarja Magnetike e Qelizave (MACS), Renditësi Mikrofluidik i Qelizave (MCS) ose teknika të tjera të shqyrtimit me rendiment të lartë, të kombinuara me etiketimin specifik të antigjenit, mund të përdoren për të shqyrtuar qelizat B individuale nga qelizat B të pasuruara për të prodhuar antitrupa të synuar.

Kur një qelizë e vetme B izolohet nga një popullatë e përzier qelizash B, gjenet e saj të antitrupave duhet të sekuencohen me anë të teknologjisë së sekuencimit të qelizave të vetme dhe të analizohen për të marrë informacionin e sekuencës së ADN-së të rajonit variabël të zinxhirit të rëndë (VH) dhe rajonit variabël të zinxhirit të lehtë (VL). Teknologjia e sekuencimit të qelizave të vetme përfshin kryesisht tre hapa: izolimin e qelizës së vetme, amplifikimin e acidit nukleik intraqelizor dhe analizën e sekuencimit. Parimi i sekuencimit të qelizave të vetme është të amplifikojë gjurmën e ADN-së ose ARN-së së tërë gjenomit të qelizave të vetme të izoluara për të marrë një gjenom ose transkriptom të plotë me mbulim të lartë për sekuencim me rendiment të lartë.

Përmes shqyrtimit me rendiment të lartë, sekuencat e gjeneve të antitrupave të mijëra qelizave B mund të merren në të njëjtën kohë, duke përshpejtuar shumë shpejtësinë e zbulimit të antitrupave. Këto informacione të sekuencave mund të përdoren më tej për ndërtimin dhe shqyrtimin e bibliotekës së antitrupave.

Fig.2 Diagrama skematike e kapjes së qelizave B të vetme, ndërtimit të bibliotekës, shqyrtimit me rendiment të lartë dhe sekuencimit.(Burimi i referencës: Sekuencimi masivisht paralel i receptorëve të qelizave B të një qelize të vetme mundëson zbulimin e shpejtë të antitrupave të ndryshëm reaktivë ndaj antigjenit..)

Amplifikimi i gjenit të antitrupave

Një qelizë e vetme B çahet për të çliruar ARNi-në. Pastaj, sekuencat e ADNc-së të rajonit variabël të zinxhirit të rëndë (VH) dhe rajonit variabël të zinxhirit të lehtë (VL) u amplifikuan me anë të reaksionit zinxhir të polimerazës së transkriptimit të kundërt (RT-PCR).

Shprehja dhe pastrimi i antitrupave

Gjeni i amplifikuar i rajonit variabël u fut në plazmidin vektorial me gjenin e rajonit konstant për të ndërtuar plazmidin e shprehjes së antitrupave monoklonalë. Pastaj, sistemi i duhur i shprehjes (sistemi eukariotik i shprehjes si qelizat CHO ose sistemi prokariotik i shprehjes si Escherichia coli) zgjidhet për shprehje, dhe merret antitrupi monoklonal me aktivitet biologjik. Kromatografia e afinitetit të proteinës A u përdor për të nxjerrë dhe pastruar antitrupat e shprehur nga kultura qelizore dhe për të marrë antitrupa monoklonalë rekombinantë me cilësi të lartë.

Validimi i antitrupave

Validimi i antitrupave i specifikës, afinitetit dhe aktivitetit biologjik me anë të ELISA, Western blot, Analizës së Flow dhe Imunokoprecipitimit për të siguruar që performanca e antitrupave i plotësoi pritjet. Validimi i antitrupave është një hap kyç në sigurimin e cilësisë dhe besueshmërisë së antitrupave.

Kërkesat për imunogjen

(1) Proteinë rekombinante: ≥2.5 mg, pastërtia e proteinës >85%, pesha molekulare e proteinës më e madhe se 10 kDa, përqendrimi i proteinave të tretshme midis 0.5 dhe 5mg/mL. Nëse kërkohet pastrim i afinitetit të antigjenit, kërkohen edhe 10 mg proteinë rekombinante shtesë.

(2) Polipeptidet dhe molekulat e vogla: Peptid i zhveshur ≥10 mg, pastërtia e peptideve >90%, jo më pak se 10 AA, çiftëzimi KLH/BSA/OVA ose proteina të tjera bartëse; Molekulat e vogla kërkojnë vlerësim strukturor paraprakisht.

Fluksi i Punës së Shërbimit të Renditjes së Qelizave B të Veçanta

Hapat	Përmbajtja e Shërbimit	Kronologjia
Hapi 1: Imunizimi i kafshëve dhe zbulimi ELISA	(1) Kafshët u imunizuan 4-5 herë, duke filluar nga doza e 4-t, u mblodh serumi për zbulimin ELISA të titrit të antitrupave (titri i serumit ELISA i antigjenit të proteinave >10^5; titri i serumit ELISA i antigjenit të peptideve >10^4). Në të njëjtën kohë, 0.1 ml serum para-imunizimit dhe pas-imunizimit u dërgohen klientëve për testim; Nëse titri nuk është i kualifikuar, imunizimi do të vazhdojë ose klienti kërkon ndërprerjen e projektit, dhe do të ngarkohet vetëm pjesa e imunizimit; (2) Nëse titri ishte i kualifikuar, qelizat PBMC u izoluan nga gjaku i plotë.	10-12 javë
Hapi 2: Renditja e qelizave B të vetme	(1) U mblodh shpretka, u përgatit një suspension i qelizave B të vetme, u mblodh gjaku periferik dhe u izoluan qelizat PBMC. (2) Shënuesit imunoantigjenë FITC dhe AF648. (3) Renditje me rrjedhje me fluoreshencë të dyfishtë + kulturë e kloneve të qelizave B të vetme. (4) Identifikimi ELISA + sekuencimi i kloneve pozitive.	2-3 javë
Hapi 3: Shprehja dhe validimi i antitrupave	(1) Sinteza e gjenit të sekuencës 6-10 + validimi i testit të shprehjes te gjitarët. (2) Identifikimi ELISA.	3-4 javë
Hapi 4: Dorëzimi	(1) Sekuencat e antitrupave: 4-6 sekuenca të antitrupave (sekuencat e pashprehura dorëzohen së bashku). (2) Çdo sekuencë e shprehur dha 0.2 mg antitrup. (3) Raport eksperimental.	1 javë