Protokolli i Renditjes së Qelizave të Vetme B dhe Pyetjet e Shpeshta

Renditja e qelizave B të vetme është një teknikë eksperimentale me precizion të lartë, e cila zakonisht përdoret për të analizuar dhe izoluar qelizat B individuale për analiza të thella të gjeneve, proteinave ose funksioneve. Limfocitet B janë një lloj i rëndësishëm qelizash në sistemin imunitar, të cilat janë kryesisht përgjegjëse për prodhimin e antitrupave dhe pjesëmarrjen në përgjigjen imunitare humorale. Për shkak të diversitetit të qelizave B dhe roleve të tyre komplekse në përgjigjet imunitare, studimet në nivelin e qelizave të vetme mund të zbulojnë karakteristikat dhe funksionet specifike të secilës qelizë B.

Parimi i Renditjes së Qelizave të Vetme B

Renditja e Citometrisë së Fluksit (FACS)

Shënuesit sipërfaqësorë të qelizave B (si CD19, CD20, IgD/IgM, etj.) dhe aftësia e lidhjes së antigjenit të synuar (siç janë sondat e antigjenit të etiketuara me fluoreshencë) u zbuluan me anë të ngacmimit me lazer të antitrupave të etiketuar me fluoreshencë. Shpërndarja përpara (FSC) dhe shpërndarja anësore (SSC) u përdorën për të dalluar madhësinë e qelizave dhe madhësinë e grimcave, dhe qelizat B të synuara u shqyrtuan me anë të sinjalit të fluoreshencës.

Teknologjia e Formimit të Pikave

Rrjedha e lëngut ndahet në pika që përmbajnë një qelizë të vetme nga dridhjet me frekuencë të lartë, dhe pikat e ngarkuara klasifikohen nga devijimi i fushës elektrike.

Renditja Mikrofluidike

Në çip, qelizat kontrollohen nga mekanika e lëngjeve ose fuqia dielektrike, dhe qelizat B të vetme kapen nga teknologjia e njohjes së imazhit.

Hapat e Renditjes së Qelizave të Vetme B

Përgatitja e mostrës

Burimi i qelizave

Mostrat e qelizave vijnë nga një sërë burimesh, duke përfshirë qelizat e nxjerra nga indet (siç janë indet tumorale, mëlçia, veshkat, etj.), gjaku dhe kulturat qelizore. Qelizat nga burime të ndryshme mund të kenë kërkesa të ndryshme për renditje dhe metoda përpunimi.

Tretja e qelizave

Kur burimi qelizor është një mostër indi, indi duhet të tretet në një pezullim të vetëm qelizor me anë të hidrolizës enzimatike. Enzimat e zakonshme tretëse përfshijnë tripsinën, kolagenazën dhe DNazën. Gjatë procesit të tretjes, përqendrimi dhe koha e reagimit të enzimës duhet të kontrollohen me saktësi për të siguruar që qelizat të mos dëmtohen tepër.

Filtrim

Për të hequr masat qelizore dhe mbeturinat që mund të prodhohen gjatë tretjes së indeve, shpesh përdoret një filtër 40μm për filtrim. Kjo siguron që qelizat e sortuara të jenë një pezullim i vetëm qelizor, duke shmangur ndërhyrjen në eksperimentet pasuese.

Numërimi i qelizave dhe zbulimi i aktivitetit

Përpara renditjes, qelizat duhet të numërohen dhe të zbulohet aktiviteti i tyre. Metoda e përdorur zakonisht është ngjyrosja me blu tripani, e cila mund të dallojë qartë qelizat e vdekura nga qelizat e gjalla dhe të sigurojë që përqindja e qelizave të gjalla të mbetet mbi 85%.

Ngjyrosja e qelizave (Opsionale)

Etiketimi fluoreshent

Në klasifikimin me citometri rrjedhëse (FACS), për të identifikuar popullata specifike qelizore, antitrupat e etiketuar me fluoreshencë zakonisht përdoren për të etiketuar antigjene specifike në sipërfaqen e qelizës. Eksperimentet e titrimit u kryen për të përcaktuar përqendrimin optimal për inkubimin e secilit antitrup fluoreshent. Me anë të etiketimit fluoreshent, mund të dallohen qelizat shënjestër dhe qelizat jo-shënjestër.

Përzgjedhja e fluoresceinës

Është shumë e rëndësishme të zgjidhni fluoresceinën e duhur. Ngjyruesit e zakonshëm fluoresceinë përfshijnë FITC (jeshile), PE (portokalli), APC (e kuqe) etj. Kur zgjidhni ngjyrat fluoresceinë, është e nevojshme të siguroheni që spektrat e emetimit të secilës fluoresceinë të mos mbivendosen.

Inkubacioni dhe larja

Pas ngjyrosjes, zakonisht inkubohet për t'u siguruar që antitrupi fluoreshent është kombinuar plotësisht me antigjenin sipërfaqësor të qelizës. Pas inkubimit, është e nevojshme të përdoret PBS ose një tampon i veçantë rrjedhës për larje për të hequr ngjyrat fluoreshente të palidhura për të parandaluar që ato të ndërhyjnë në rezultatet e renditjes.

Renditja e qelizave

Renditja me citometri me rrjedhje (FACS)

Parimi: Teknologjia e renditjes me citometri rrjedhëse bazohet në karakteristikat e madhësisë së qelizave, morfologjisë dhe etiketimit fluoreshent për të renditur qelizat. Citometria rrjedhëse (p.sh. BD FACSAria) u përdor për të dalluar popullatat qelizore me anë të rrezatimit me lazer të mostrave dhe me anë të dritës së shpërndarë (FSC / SSC). Qelizat e vdekura, grumbujt e qelizave dhe mbeturinat zakonisht përjashtohen. Kontrolli pozitiv i vetëm dhe kontrolli FMO (Fluoreshencë Minus Një) u përdorën për të rregulluar mbivendosjen spektrale dhe për të kontrolluar kompensimin.

Procesi: Vendosni strategji të ndryshme të kontrollit të qelizave, të tilla si FSC dhe SSC si standard për shqyrtimin e trashë, dhe më pas zgjidhni me saktësi nëngrupet e qelizave të synuara përmes sinjaleve fluoreshente. Qelizat e vetme mund të mblidhen direkt në tuba PCR, pllaka me 96 puseta ose media kultivimi.

Renditja me rruaza magnetike (MACS)

Parimi: Teknologjia e klasifikimit me sfera magnetike përdor kolonën e ndarjes magnetike për klasifikimin pas etiketimit të molekulave në sipërfaqen e qelizave të synuara (siç janë qelizat CD3 + T) me antitrupa specifikë. Duke kapur qelizat e etiketuara me sfera magnetike nën veprimin e një fushe magnetike, kryhet përzgjedhja pozitive ose negative.

Karakteristikat: Metoda e klasifikimit me sfera magnetike është e përshtatshme për klasifikimin e qelizave në shkallë të gjerë, dhe shpejtësia e përpunimit është më e shpejtë, por pastërtia është zakonisht më e ulët se ajo e klasifikimit me citometri rrjedhëse, e cila është e përshtatshme për aplikime që nuk kërkojnë pastërti jashtëzakonisht të lartë.

Renditja mikrofluide me qeliza të vetme

Parimi: Çipat mikrofluidikë (siç është 10X Genomics) përdorin kanale të vogla lëngjesh për të manipuluar me saktësi qelizat. Nëpërmjet teknologjisë së pikave ujë-në-vaj, çdo pikë përmban një qelizë të vetme, duke siguruar që çdo qelize t'i jepet një mjedis i veçantë, dhe mund të kryhet renditja e qelizave të vetme dhe të ndërtohet shpejt një bibliotekë.

Avantazhet: Është i përshtatshëm për analiza të një qelize të vetme në shkallë të gjerë dhe me rendiment të lartë, mund të zvogëlojë në mënyrë efektive gabimet operative dhe është i përshtatshëm për sekuencimin e ARN-së të një qelize të vetme dhe kërkime të tjera.

Kontrolli i Cilësisë dhe Ruajtja

Ekzaminim mikroskopik

Qelizat e sortuara duhet të ekzaminohen me mikroskop për të konfirmuar morfologjinë dhe integritetin e qelizave. Zakonisht kontrolloni nëse qelizat kanë dëmtime të dukshme morfologjike ose mbeturina.

Zbulimi i aktivitetit të një qelize të vetme

Për të siguruar efektivitetin e eksperimenteve pasuese, zakonisht zbulohet statusi i aktivitetit të qelizave të vetme të përzgjedhura. Metoda e përdorur zakonisht është përcaktimi i cilësisë së ARN-së (p.sh., vlera e integritetit të ARN-së, RIN) për të siguruar integritetin e ARN-së.

Modaliteti i ruajtjes

Qelizat e vetme të sortuara mund të zgjedhin mënyra të ndryshme ruajtjeje sipas nevojave të tyre. Ruajtja afatshkurtër mund të vendoset në frigorifer në 4℃, ndërsa ruajtja afatgjatë kërkon shtimin e tretësirës së krioprezervimit dhe vendosjen në -80℃ ose azot të lëngshëm për të parandaluar vdekjen e qelizave ose degradimin e ARN-së.

Analiza e ndjekjes

Sekuencimi i një qelize të vetme

Qelizat e vetme që janë renditur dhe ruajtur zakonisht i nënshtrohen analizave të mëtejshme biologjike molekulare, më e zakonshmja prej të cilave është sekuencimi i ARN-së me një qelizë të vetme (scRNA-seq). Përveç kësaj, ka zbatime të tilla si ATAC-seq me një qelizë të vetme (analiza e hapjes së kromatinës) dhe proteomika me një qelizë të vetme.

Kulturë me qeliza të vetme

Qelizat e vetme të renditura mund të përdoren gjithashtu për kulturën e kloneve për të studiuar sjelljen e popullatave specifike qelizore, siç janë qelizat staminale dhe qelizat staminale kancerogjene. Mund të përdoret gjithashtu për krijimin e modelit qelizor dhe shqyrtimin e barnave.

Eksperimente funksionale

Qelizat pas klasifikimit të qelizave të vetme mund të përdoren gjithashtu për eksperimente funksionale siç janë zbulimi imunitar, shqyrtimi i barnave, analiza fenotipike, etj., për të studiuar karakteristikat biologjike ose përgjigjen e qelizave ndaj barnave.

Figura 1. Rrjedha e punës së hulumtimit: Një kombinim i antitrupave neutralizues të gjerë njerëzorë kundër HBsAg të virusit të hepatitit B me epitope të dallueshme shtyp mutacionet e arratisjes. (Burimi i referencës: Një kombinim i antitrupave neutralizues gjerësisht njerëzorë kundër HBsAg të virusit të hepatitit B me epitope të dallueshme shtyp mutacionet e arratisjes.)

Alpha Lifetech ofron analiza të klasifikimit të qelizave B të vetme për t'u ofruar klientëve shërbime efikase dhe të sakta të analizës së qelizave të vetme. Nëpërmjet teknologjisë së përparuar të citometrisë me rrjedhje, ne mund të izolojmë dhe shqyrtojmë me saktësi qelizat B të synuara për të ndihmuar klientët të marrin të dhëna eksperimentale me cilësi të lartë në fushat e kërkimit imunologjik, zhvillimit të vaksinave dhe shqyrtimit të antitrupave.

Pyetje të shpeshta

1. Efikasiteti i ulët i renditjes së qelizave çon në numrin e pamjaftueshëm të qelizave të synuara.

Përqendrimi i qelizave të mostrës para renditjes ishte rritur. Kontrolloni nëse gryka është e bllokuar. Rregulloni parametrat e renditjes së citometrit të rrjedhës, siç janë shpejtësia e rrjedhës dhe mënyra e renditjes. Optimizoni përdorimin e antitrupave për të siguruar që qelizat B të synuara të mund të etiketohen në mënyrë efektive. Renditja e rrjedhës ndihmohet nga teknologji të tjera (siç është renditja me sfera magnetike).
2. Limfocitet B të renditura mund të humbasin funksionin e tyre ose të ulin aktivitetin.

Zgjidhje: Sigurohuni që procesi i renditjes të jetë sa më i butë të jetë e mundur për të zvogëluar humbjen e funksionit qelizor. Shtimi i 2 mM EDTA dhe 1% BSA në tamponin e renditjes mund të rrisë aktivitetin qelizor. U përdorën kushte dhe mjedis i përshtatshëm kulture për të ruajtur aktivitetin dhe funksionin qelizor. Në kohën e shkurtër pas renditjes, qelizat përdoren për eksperimente pasuese për të shmangur humbjen funksionale.
3. Nëse shënuesit e sipërfaqes së qelizave B të përzgjedhur nuk janë të saktë, kjo mund të çojë në rezultate të pakënaqshme të renditjes.

Antitrupat specifikë të etiketuar me fluoreshencë përdoren për të ngjyrosur molekulat shënuese sipërfaqësore të qelizave B. Antitrupat e përdorur zakonisht përfshijnë antitrupa kundër shënuesve specifikë të qelizave B, siç janë CD19, CD20 dhe CD38. Kontrolloni specifikën dhe reaktivitetin e antitrupit për të shmangur reaksionin kryq. Përdorimi i strategjive të shumëfishta të etiketimit, të kombinuara me shënues të shumëfishtë sipërfaqësorë për të përmirësuar saktësinë e renditjes.
4. Gjatë procesit të klasifikimit me citometri rrjedhëse mund të shfaqen papastërti (si flluska, grimca të humbura), duke ndërhyrë në klasifikimin e qelizave.

Sigurohuni që rruga optike e citometrit të rrjedhës është e pastër dhe shmangni ndërhyrjen e dritës së shpërndarë. Kalibroni rregullisht pajisjet për të siguruar saktësinë e citometrit të rrjedhës.
5. Efikasiteti i ulët i klasifikimit të qelizave çon në numrin e pamjaftueshëm të qelizave të synuara.

Përqendrimi i qelizave të mostrës para renditjes ishte rritur. Kontrolloni nëse gryka është e bllokuar. Rregulloni parametrat e renditjes së citometrit të rrjedhës, siç janë shpejtësia e rrjedhës dhe mënyra e renditjes. Optimizoni përdorimin e antitrupave për të siguruar që qelizat B të synuara të mund të etiketohen në mënyrë efektive. Renditja e rrjedhës ndihmohet nga teknologji të tjera (siç është renditja me sfera magnetike).

referencë

[1] Lei L, Tran K, Wang Y, etj. Renditja e qelizave të vetme B specifike për antigjenin dhe klonimi i antitrupave monoklonalë në derrat e Guinesë. Front Microbiol. 2019;10:672. Botuar më 23 prill 2019. doi:10.3389/fmicb.2019.00672

[2] Tomlinson JE, Wagner B, Felippe MJB, Van de Walle GR. Renditja e qelizave të aktivizuara me fluoreshencë multispektrale e nënpopullatave të qelizave B dhe T nga gjaku periferik i kuajve. Vet Immunol Immunopathol. 2018;199:22-31. doi:10.1016/j.vetimm.2018.03.010

[3] Lin W, Liang WC, Nguy T, etj. Identifikimi i shpejtë i mAbs anti-idiotipike me afinitet të lartë dhe epitope të larmishme me anë të teknologjisë së klasifikimit, kulturës dhe klonimit të qelizave B të vetme të lepurit. PLoS One. 2020;15(12):e0244158. Botuar më 21 dhjetor 2020. doi:10.1371/journal.pone.0244158

[4] Zhou Y, Liu Z, Wang Z, etj. Renditja e qelizave të vetme të qelizave të kujtesës B që lidhen me HBsAg nga qelizat mononukleare të gjakut periferik të njeriut dhe klonimi i antitrupave. Protokolli STAR. 2020;1(3):100129. Botuar më 16 tetor 2020. doi:10.1016/j.xpro.2020.100129

[5] Nogales-Gadea G, Saxena A, Hoffmann C, etj. Gjenerimi i Antitrupave Monoklonalë IgG Njerëzorë Rekombinantë nga Qelizat B të Imortalizuara të Renditura. J Vis Exp. 2015;(100):e52830. Botuar më 5 qershor 2015. doi:10.3791/52830

[6] Ibrahim SF, van den Engh G. Citometria me rrjedhje dhe klasifikimi i qelizave. Adv Biochem Eng Biotechnol. 2007;106:19-39. doi:10.1007/10_2007_073