Protokolli i Ndërtimit të Linjës së Qelizave Stabile dhe Pyetjet e Shpeshta

Një linjë qelizore e qëndrueshme mund ta shprehë në mënyrë të qëndrueshme gjenin e synuar për një kohë të gjatë pa presion përzgjedhjeje duke integruar gjenin ekzogjen në gjenomën e qelizës pritëse. Krahasuar me transfektimin kalimtar, linjat qelizore të qëndrueshme jo vetëm që mund të ofrojnë rezultate eksperimentale të qëndrueshme dhe të përsëritshme, por edhe ta zvogëlojnë shumë ndryshueshmërinë e eksperimenteve. Është një mjet i rëndësishëm për kërkimin biologjik dhe zbatimin industrial.

Në fillim të shekullit të 20-të, shkencëtarët kishin filluar të përpiqeshin të kultivonin qelizat in vitro, gjë që hodhi themelet për ndërtimin e mëvonshëm të linjave qelizore. Në mesin e shekullit të 20-të, teknologjia e kulturës qelizore u pjekur gradualisht, dhe qelizat HeLa të Henrietta Lacks u bënë linja e parë qelizore njerëzore e përdorur gjerësisht, duke shënuar fillimin e kërkimit të linjave qelizore të pavdekshme. Shkencëtarët filluan të eksploronin metodën e futjes së ADN-së ekzogjene në qeliza. Shumica e eksperimenteve në këtë periudhë ishin transfeksion kalimtar pa integrim të qëndrueshëm. Në fund të viteve 1997, me zhvillimin e teknologjisë së klonimit molekular, shkencëtarët ishin në gjendje të manipulonin më mirë sekuencat e ADN-së. Kjo periudhë dëshmoi gjithashtu zbatimin e sistemit të shënjuesve të përzgjedhjes së antibiotikëve në ndërtimin e linjave qelizore të qëndrueshme. Mjete të tilla si virusi SV40 përdoren për të rritur shprehjen e ADN-së ekzogjene në qelizat e gjitarëve. Në vitin 1998, njerëzit filluan të përdorin vektorë plazmidë dhe vektorë viralë për integrimin e gjenomit. Përparimet teknologjike në këtë periudhë kanë mundësuar që gjenet e synuara të futen më efektivisht në gjenomën pritëse. Futja e gjeneve të rezistencës (siç është gjeni i rezistencës ndaj neomicinës neo) bën të mundur përzgjedhjen e qelizave që mbajnë gjene të huaja përmes shqyrtimit të barnave. Në vitin 1999, shkalla e suksesit të transfektimit të gjeneve ekzogjene u përmirësua shumë nga aplikimi i gjerë i metodave efikase të futjes së ADN-së, siç është transfektimi i ndërmjetësuar nga lipozomet dhe elektroporimi. Në të njëjtën kohë, zhvillimi i citometrisë së rrjedhjes ka promovuar gjithashtu shqyrtimin e qelizave monoklonale. Që nga shekulli i 21-të, me rritjen e teknologjive të redaktimit të gjeneve, siç është CRISPR-Cas9, saktësia e ndërtimit të linjës qelizore të qëndrueshme është përmirësuar shumë dhe shkencëtarët kanë qenë në gjendje të kryejnë futjen dhe nxjerrjen jashtë të gjeneve në mënyrë më specifike. Përveç kësaj, zhvillimi i njohjes dhe sintezës së përforcuesve, promotorëve të optimizuar, etj., ka përmirësuar nivelin e shprehjes dhe stabilitetin e gjeneve të huaja.

Hapat e Ndërtimit të Linjës së Qëndrueshme Qelizore

Ndërtimi i Vektorit

Së pari, u përzgjodh gjeni i përshtatshëm cak sipas objektivave të kërkimit. Sekuencat e gjeneve u analizuan me anë të mjeteve bioinformatike për t'u siguruar që ato ishin të përshtatshme për shprehje pa struktura të forta sekondare ose sekuenca që nuk ishin të favorshme për transkriptim dhe përkthim. Për të lehtësuar operacionin pasues të klonimit, u krijuan vende specifike kufizuese në të dy skajet e gjenit cak, të cilat mund të përputheshin me vendet e shumëfishta të klonimit të vektorit në ndërtimin pasues.

Vektori dhe fragmenti i gjenit të synuar u tretën me endonukleazë restriktive, dhe gjeni i synuar u fut në vendin e klonimit të shumëfishtë të vektorit të shprehjes nga ligaza e ADN-së T4. Produkti i lidhur u transformua në E.coli për të përftuar koloni të shumëfishta rekombinante. Pas shqyrtimit PCR të kolonive ose nxjerrjes së një sasie të vogël të plazmidit, klonet pozitive u përzgjodhën për verifikimin e sekuencimit për t'u siguruar që gjeni i synuar ishte futur saktë dhe nuk kishte mutacion.

Transfeksion qelizor

Duhet të zgjidhet linja qelizore pritëse e përshtatshme për eksperimentin. Zakonisht, qelizat duhet të transfektohen në fazën e rritjes logaritmike për të siguruar që ato të kenë gjendjen më të mirë dhe aftësinë efikase të thithjes së ADN-së. Dendësia e qelizave duhet të arrijë një bashkim prej 50-70%, që është dendësia e rekomanduar për shumicën e reagentëve të transfektimit dhe mund të rregullohet me anë të numëruesit të qelizave ose vëzhgimit me mikroskop. Pastaj, metoda e përshtatshme e transfektimit u zgjodh sipas llojit të qelizës. Për qelizat ngjitëse, përdoret zakonisht metoda e ndërmjetësuar nga lipozomet; qelizat e pezulluara mund të kërkojnë elektroporim. Për të optimizuar kushtet e transfektimit, duhet të merren në konsideratë variabla të tilla si përqendrimi i ADN-së, dendësia e qelizave dhe lloji i mediumit. Kushtet optimale u përcaktuan duke vendosur një eksperiment kontrolli.

Shqyrtimi i rezistencës

Në përgjithësi, 24-48 orë pas transfektimit, qelizat janë rikuperuar mirë dhe është shtuar një sasi e përshtatshme antibiotikësh selektivë për shqyrtim. Përzgjedhja e antibiotikëve bazohet në gjenet e rezistencës që përmbahen në vektorët e përdorur, siç janë neomicina (G418), puromicina, etj. Për të siguruar integrimin e suksesshëm të gjeneve të rezistencës, është e nevojshme të vëzhgohet vazhdimisht dhe të zëvendësohet rregullisht mjedisi që përmban antibiotikë. Ky proces zakonisht zgjat 1-2 javë derisa të vdesin të gjitha qelizat e kontrollit të patransfektuara dhe qelizat e transfektuara të mbijetojnë dhe të rriten normalisht. Gjatë kësaj periudhe, mjedisi i thatë duhet të shmanget dhe antibiotikët duhet të plotësohen me kohë.

Përzgjedhja e klonimit dhe amplifikimi

Pasi të merren qelizat rezistente të popullatës, hapi tjetër është të kryhet renditja monoklonale në këto qeliza. Metoda e hollimit të kufizuar është hollimi i qelizave në përqendrime jashtëzakonisht të ulëta dhe shpërndarja e tyre në një pllakë me 96 puseta për të siguruar që secila pus përmban maksimumi një qelizë. Ose citometria me rrjedhë mund të përdoret për të renditur qelizat e vetme më saktë. Monoklonalet e përzgjedhura duhet të amplifikohen në kushte standarde të kulturës. Çdo hap në këtë proces duhet të shmangë kontaminimin e kryqëzuar, të etiketojë me kujdes çdo klon dhe të regjistrojë statusin e tij të rritjes. Pas disa raundeve të amplifikimit, mund të merret një linjë qelizore e qëndrueshme.

Verifikimi i Gjenit

Integrimi i gjenit të synuar u zbulua me anë të PCR duke nxjerrë ADN-në gjenomike të kloneve kandidate. Amplifikimi PCR mund të konfirmojë paraprakisht nëse gjeni i synuar ekziston dhe integrohet në gjenomën pritëse. Pas konfirmimit të integrimit të gjenit, niveli i shprehjes së tij duhet të verifikohet më tej. qPCR u përdor për të zbuluar shprehjen e ARNi-së së gjenit të synuar dhe për të dhënë rezultate sasiore. Western blot përdoret për të zbuluar nivelet e proteinave për të siguruar që gjenet pas transkriptimit mund të përkthehen ende në mënyrë efektive në proteina. Pas sigurimit që këta tregues plotësojnë kërkesat eksperimentale, linja qelizore mund të identifikohet si një klon kandidat për shprehje të qëndrueshme.

Figura 1. Strategjia për gjenerimin e linjës qelizore të paketimit pseudotipizuar. (Burimi i referencës: Një linjë qelizash paketimi e qëndrueshme e derivuar nga njeriu për prodhimin e pseudotipeve G të retrovirusit/stomatitit vezikular me titër të lartë.）

Zbatimi i Ndërtimit të Linjës së Qëndrueshme Qelizore

Hulumtime Bazë

Për kërkimin e funksionit të gjeneve, analizën e rrugëve të sinjalit dhe kërkimin epigjenetik.

Biofarmaceutikë

Prodhim në shkallë të gjerë i proteinave terapeutike, siç janë antitrupat monoklonalë, hormonet, etj.

Zhvillimi i Barnave

Verifikimi i shënjestrës së ilaçit, vlerësimi i efikasitetit.

Në kërkimin shkencor të jetës sot, linjat qelizore të qëndrueshme, si një mjet shumë i rëndësishëm, përdoren gjerësisht në shqyrtimin e barnave, analizën e funksionit të gjeneve dhe shprehjen e proteinave dhe fusha të tjera. Alpha Lifetech ofron shërbime të ndërtimit të linjave qelizore të qëndrueshme dhe zgjidhje të përshtatura për klientët globalë.

Pyetje të shpeshta

1. Efikasitet i ulët i transfektimit.

Përshkrimi i problemit: Efikasiteti i ulët i transfeksionit do të çojë në numër të pamjaftueshëm të kloneve pozitive, gjë që do të ndikojë në shqyrtimin pasues. Zgjidhjet: (1) Optimizoni kushtet e transfeksionit: rregulloni përqendrimin e ADN-së, dendësinë e qelizave dhe sasinë e reagentit të transfeksionit. (2) Zgjidhni metodën e duhur të transfeksionit: për shembull, përdorni elektroporimin për të përmirësuar efikasitetin e disa linjave qelizore të vështira për t'u transfeksionuar. (3) Përdorni reagentë efikasë të transfeksionit: Për lloje specifike qelizash, provoni reagentë të ndryshëm komercialë të transfeksionit.
2. Shkalla e ulët e mbijetesës së kloneve rezistente.

Përshkrimi i problemit: Në fazën e shqyrtimit të antibiotikëve, disa ose të gjitha qelizat vdiqën. Zgjidhjet: (1) Optimizimi i përqendrimit të antibiotikëve: Së pari, u kryen eksperimente gradienti për të përcaktuar përqendrimin minimal efektiv për të shmangur citotoksicitetin jo-specifik të shkaktuar nga përqendrimi shumë i lartë. (2) Zgjatja e kohës së rikuperimit: Lërini qelizat të rikuperohen për një periudhë kohore pa presion selektiv përpara se të filloni shqyrtimin e antibiotikëve.
3. Niveli i shprehjes së gjenit është i paqëndrueshëm ose shumë i ulët.

Përshkrimi i problemit: Edhe nëse klonet pozitive u skrinuan me sukses, niveli i shprehjes së gjenit të synuar nuk i plotësonte kërkesat eksperimentale. Zgjidhja: (1) Zgjidhni promotorin e duhur: zgjidhni një promotor të fortë sipas karakteristikave të qelizës pritëse për të përmirësuar nivelin e shprehjes. (2) Integrimi me shumë kopje: Rritni numrin e kopjeve të gjenit të integruar duke rritur përqendrimin e vektorit ose duke përdorur një vektor me një vend futjeje me shumë kopje. (3) Zgjidhni linjat qelizore të përshtatshme: Disa qeliza vetë kanë frenim natyror të shprehjes së gjeneve të huaja, mund të provoni të zëvendësoni linjën qelizore.
4. Problemi i pastërtisë së klonimit.

Përshkrimi i problemit: Qelizat monoklonale të përftuara mund të jenë heterogjene dhe të përmbajnë një sërë prejardhjesh gjenetike. Zgjidhja: (1) Ndarja me hollim të përsëritur: Hollimi i kufizuar ose citometria me rrjedhje (FACS) u përdor për renditje të shumëfishtë për të siguruar që çdo klon rrjedh nga një qelizë e vetme. (2) Gjenotipizimi: Çdo klon u verifikua me PCR ose sekuencim për të konfirmuar se ishte një klon i vetëm.
5. Stabilitet i dobët i klonimit.

Përshkrimi i problemit: Me rritjen e numrit të pasazheve, niveli i shprehjes së gjenit të synuar u ul gradualisht. Zgjidhjet: (1) Kulturë me pasazh të ulët: minimizoni numrin e pasazheve dhe përfundoni eksperimentet pasuese në pasazhet më të ulëta. (2) Shqyrtim periodik: kultivoni rregullisht në kushte selektive për të ruajtur presionin e përzgjedhjes së gjeneve të rezistencës. (3) Përdorni sisteme shprehjeje më të qëndrueshme: për shembull, zgjidhni sisteme të ngulitura në fragmente homologe të rekombinimit për të arritur integrim më të qëndrueshëm të gjeneve.

referencë

[1] Chen LQ, Wang YN, Li DY, etj. Ndërtimi i një linje qelizore me shprehje të qëndrueshme të fosfolambanit njerëzor. Fa Yi Xue Za Zhi. 2021; 37 (5): 615-620. doi:10.12116/j.issn.1004-5619.2020.400909

[2] Lü X, Zhou Z, Zhu L, Zhou J, Huang H, Zhang C, Liu X. [Ndërtimi dhe identifikimi i një linje qelizore HEK293 me mbishprehje të qëndrueshme të TrxR1]. Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao. 20 Prill 2022;42(4):554-560. Kinezisht. doi: 10.12122/j.issn.1673-4254.2022.04.11.

[3] Ory DS, Neugeboren BA, Mulligan RC. Një linjë qelizash paketimi e qëndrueshme e derivuar nga njeriu për prodhimin e pseudotipeve G të virusit të retrovirusit/stomatitit vezikular me titër të lartë. Proc Natl Acad Sci US A. 1996;93(21):11400-11406. doi:10.1073/pnas.93.21.11400

[4] Wei LY, Lu N, Meng L, Li XJ, Li L, Li CK, Li DL. [Ndërtimi i vektorit eukariotik që shpreh P2X7 njerëzore dhe krijimi i linjës qelizore transfektante të qëndrueshme]. Zhongguo Ying Yong Sheng Li Xue Za Zhi. 8 maj 2016;32(5):471-475. Kinezisht. doi: 10.13459/j.cnki.cjap.