Protokolli Western Blotting dhe Pyetjet e Shpeshta

Western blotting është një teknikë e përdorur gjerësisht si në kërkimin shkencor ashtu edhe në diagnostikën klinike, duke ofruar një metodë të besueshme për analizimin e proteinave në përzierje komplekse. Përdoret kryesisht për zbulimin e proteinave specifike, si dhe për përcaktimin e bollëkut të tyre relativ në mostra të ndryshme. Duke përdorur antitrupa specifikë që lidhen me proteinën e synuar, Western blotting lejon identifikimin dhe përcaktimin sasior të proteinave me interes brenda një mostre heterogjene. Kjo teknikë është veçanërisht e vlefshme në studimin e proceseve të pastrimit të proteinave, duke u mundësuar studiuesve të vlerësojnë pastërtinë dhe praninë e proteinave në faza të ndryshme të pastrimit. Përveç kësaj, Western blotting luan një rol vendimtar në vlerësimin e niveleve të shprehjes së proteinave në qeliza në kushte të ndryshme eksperimentale, të tilla si në përgjigje të ilaçeve, stresit ose sëmundjes. Shkathtësia e saj e ka bërë atë një gur themeli në shumë fusha, duke përfshirë biologjinë qelizore, biologjinë molekulare, biokiminë dhe diagnostikën klinike, ku përdoret për të hetuar mekanizmat themelorë molekularë të sëmundjeve, duke përfshirë kancerin, çrregullimet neurodegjenerative dhe gjendjet imunitare.

Historia e Western blotting daton që nga viti 1979, kur biologu britanik Alistair J. Towbin dhe kolegët e tij propozuan dhe zbatuan për herë të parë këtë metodë në kërkimin e tyre. Towbin et al. fillimisht përdorën elektroforezën për të ndarë proteinat dhe për t'i transferuar ato përmes një membrane polietileni, dhe më pas kryen zbulim specifik përmes antitrupave. Kjo metodë është përdorur gjerësisht në kërkimin e biologjisë qelizore dhe biologjisë molekulare, dhe është bërë një nga teknikat standarde të arta për analizën e proteinave.

Parimi i Western Blotting

Ndarja e proteinave

Së pari, proteinat në mostër u ndanë me anë të elektroforezës në xhel (zakonisht SDS-PAGE, elektroforezë në xhel poliakrilamid) sipas madhësisë molekulare.

Transferimi i proteinave

Proteina e ndarë transferohet më pas me anë të elektroforezës në një mbështetëse të ngurtë, zakonisht një membranë poliviniliden fluoride (PVDF) ose një membranë nitroceluloze.

Zbulimi i Antitrupave

Në membranën e transferuar, përdoren antitrupa specifikë për të njohur proteinën e synuar. Ky antitrup zakonisht është i etiketuar (si etiketimi i enzimave) dhe mund të prodhojë sinjale të matshme (si kemilumineshenca).

Zbulimi i sinjalit

Sinjali i reaksionit antitrup-antigjen merret nga një sistem i përshtatshëm zbulimi (siç është një pajisje imazherie me kemilumineshencë) për të arritur analizë cilësore dhe sasiore të proteinës së synuar.

Reagentë dhe instrumente të nevojshme

1Tamponi i elektroforezës: përdoret për ndarjen e proteinave në xhel SDS-PAGE dhe sistemin e elektroforezës.
2 Tretësirë bllokuese: siç është pluhuri i qumështit të skremuar ose BSA, për të parandaluar lidhjen jospecifike të antitrupave.
3 Antitrupi primar dhe antitrupi sekondar: Antitrupi primar është një antitrup specifik kundër proteinës së synuar, dhe antitrupi sekondar është përgjithësisht një antitrup i shënuar me enzimë i lidhur me antitrupin primar.
4 Tretësira e substratit: siç është substrati i kemilumineshencës ose substrati kolorimetrik, përdoret për zbulimin e sinjalit të antitrupave të etiketuar.
5 Kalibratorët e proteinave: Standardet e proteinave, të tilla si madhësi të paracaktuara, përdoren për të konfirmuar peshën molekulare të proteinës në mostër.
6 Sistemi i elektroforezës në xhel SDS-PAGE: për ndarjen e proteinave.
7 Sistemi transmembranor: përdoret për transferimin e proteinave nga xheli në membranë.
8Sistemi i imazherisë me kimilumineshencë: përdoret për të zbuluar sinjalin pas reaksionit antitrup-antigjen.
9 Shaker: për inkubimin e antitrupave.
10Mikropipetor: për shpërndarje precize të reagentëve dhe mostrave.
11 Membrana: Membrana PVDF ose membrana e nitrocelulozës zakonisht përdoret për transferimin e proteinave dhe zbulimin e antitrupave.

Hapat e Western Blotting

Përgatitja e mostrës

Liza e qelizave

Nxjerrja e proteinave nga qelizat ose indet. Tamponi i lizës që përdoret zakonisht përmban frenues të proteazës dhe frenues të fosfatazës për të shmangur degradimin e mostrës gjatë nxjerrjes.

Kuantifikimi i proteinave

Përqendrimi i proteinave u përcaktua me metodën BCA dhe metodën Bradford.

Ndarja me Elektroforezë (SDS-PAGE)

Përgatitja e mostrës

Mostra u përzie me tamponin e mostrës SDS dhe u ngroh në 95 °C për 5-10 minuta për të siguruar denatyrimin e plotë të proteinës.

Elektroforezë xhel

Mostrat e proteinave të trajtuara u ngarkuan në xhel SDS-PAGE, zakonisht duke përdorur xhel poliakrilamid. Zbatimi i fushës elektrike bën që proteina të ndahet sipas madhësisë molekulare, dhe proteina me peshë të vogël molekulare migron më shpejt.

Film Transferimi

Transferimi i proteinave

Proteina e ndarë transferohet në një membranë nitroceluloze (membrana NC) ose në një membranë fluoride poliviniliden (membrana PVDF) me anë të elektrotransferimit.

Bllokimi

Për të zvogëluar lidhjen jospecifike, një tretësirë bllokuese që përmbante emulsion pa yndyrë (BSA ose pluhur qumështi të skremuar) u përdor për të bllokuar zonën bosh në membranë, zakonisht për 1 orë.

Inkubacioni i Antitrupave

Inkubacioni primar i antitrupave

Membranës iu shtua një tretësirë që përmbante një antitrup primar specifik (antitrupi kryesor kundër proteinës së synuar), zakonisht i inkubuar për 1 orë deri gjatë natës.

Larje

Lani membranën me TBS-T (TBS me Tween-20) për të hequr antitrupat primarë të palidhur.

Inkubimi i antitrupave sekondarë

Inkubimi me një antitrup sekondar të etiketuar (zakonisht HRP ose antitrup sekondar të etiketuar me fluoreshencë), antitrupi sekondar mund të lidhet me antitrupin primar dhe të amplifikojë sinjalin.

Zbulimi i sinjalit

Zbulimi i kimilumineshencës

Nëse përdoret një antitrup sekondar i shënuar me HRP, shtohet një substrat i kemilumineshencës (siç është ECL) dhe një sinjal i kemilumineshencës që mund të zbulohet nga një instrument ekspozimi gjenerohet përmes një reaksioni kimik.

Zbulimi i fluoreshencës

Nëse përdoret një antitrup sekondar i etiketuar me fluoreshencë, ai zbulohet nga një pajisje imazherie me fluoreshencë.

Analiza e rezultateve

Imazheria e bandave të proteinave

Sinjali i kapur nga sistemi i imazherisë do të shfaqet si një brez proteine, dhe intensiteti i brezit lidhet me shprehjen e proteinës së synuar.

Analiza sasiore

Intensiteti i brezave u analizua nga softueri, dhe niveli i shprehjes së proteinës së synuar u llogarit dhe u krahasua me proteinën e referencës së brendshme (siç është β-aktina ose GAPDH).

Figura 1. Paraqitje skematike e Procedurës Western Blotting. (Burimi i referencës: Pastrimi dhe analiza e proteinave: teknikat e Western blotting të gjeneratës së ardhshme.）

Pyetje të shpeshta

1. Cili është ndryshimi midis membranave të nitrocelulozës dhe PVDF?

Membranat e nitrocelulozës janë më të lehta për t'u trajtuar, kanë zhurmë më të ulët në sfond dhe janë të përshtatshme për shumë aplikime. Megjithatë, ato kanë kapacitet të kufizuar të lidhjes së proteinave. Membranat PVDF kanë një kapacitet më të lartë të lidhjes së proteinave dhe janë më të qëndrueshme, duke i bërë ato ideale për ruajtjen afatgjatë të proteinave të blotuara. Ato kërkojnë aktivizim me metanol para përdorimit.
2. Si ta zgjidhim sfondin e lartë të diagramit Western blotting?

Sinjalet e sfondit të lartë në Western blotting shpesh shkaktohen nga lidhja jo-specifike e antitrupave ose bllokimi jo i plotë. (1) Optimizimi i tretësirës bllokuese: Bllokimi është thelbësor për të parandaluar lidhjen jo-specifike të antitrupave në membranë. Bllokuesit e zakonshëm përfshijnë pluhurin e qumështit të skremuar, albuminën e serumit të gjedhit (BSA) ose tamponin bllokues komercial. (2) Përmirësimi i hapave të larjes: Larja joadekuate midis hapave mund të çojë në lidhje të mbetur të antitrupave, duke rritur sfondin. Sigurohuni që të lani plotësisht me një tampon larës të përshtatshëm (zakonisht TBST ose PBST) për të hequr çdo antitrup të palidhur. Rritni numrin e larjeve ose kohëzgjatjen e larjes nëse është e nevojshme, veçanërisht nëse sfondi i lartë vazhdon. Përdorimi i shumë antitrupave mund të çojë në lidhje jo-specifike dhe të çojë në sfond të lartë. Mundohuni të holloni më tej antitrupin primar ose sekondar, ose përdorni një antitrup më specifik për të ulur sfondin.
3. Vija të paqarta ose të paqarta.

Vijat e turbullta ose të paqarta në një Western blot mund të vijnë si pasojë e ndarjes jo të plotë të elektroforezës ose transferimit të pamjaftueshëm të membranës. Nëse proteina nuk është e ndarë mirë gjatë elektroforezës, mund të shfaqen breza të turbullt. Rregulloni kohën e funksionimit, tensionin dhe përqendrimin e xhelit të elektroforezës për të arritur ndarje të qartë të proteinave. Transferimi jo i plotë i proteinave nga xheli në membranë mund të çojë në breza të turbullt ose që mungojnë. Sigurohuni që të përdoret lloji i duhur i membranës (p.sh. PVDF ose nitrocelulozë) dhe që kushtet e transferimit janë optimale. Rregulloni tensionin e transferimit, kohën dhe përbërjen e tamponit nëse është e nevojshme.
4. Sinjali është shumë i dobët kur ekspozohet.

(1) Rritja e përqendrimit të antitrupave: Nëse përqendrimi i antitrupave është shumë i ulët, sinjali mund të jetë shumë i dobët për t'u zbuluar saktë. Merrni në konsideratë rritjen e përqendrimit të antitrupit të parë ose të antitrupit të dytë dhe kryeni titrimin e antitrupave për të gjetur përqendrimin optimal të antitrupave për të rritur lidhjen me proteinën e synuar. (2) Sigurimi i transferimit të plotë të membranës: Transferimi jo i plotë i proteinave nga xheli në membranë mund të çojë gjithashtu në sinjale të dobëta ose të munguara. Pas transferimit, membrana ekzaminohet duke përdorur ngjyrosje të kthyeshme të proteinave për të siguruar transferimin e saktë të proteinës. Nëse efikasiteti i transmetimit është i ulët, kushtet si tensioni, koha, përbërja e tamponit dhe pajisjet e transmetimit optimizohen. (3) Zgjatja e kohës së ekspozimit: Nëse sinjali është shumë i dobët, balanconi kohën e ekspozimit dhe qartësinë e sinjalit dhe përdorni gjatësi të ndryshme të ekspozimit të testit për të gjetur kohën më të mirë për të siguruar një raport të mirë sinjal-zhurmë.

referencë

[1] Sule R, Rivera G, Gomes AV. Western blotting (imunoblotting): historia, teoria, përdorimet, protokolli dhe problemet. Biotechniques. 2023;75(3):99-114. doi:10.2144/btn-2022-0034

[2] Kurien, BT, & Scofield, RH (2015). Western blotting: një hyrje. Metodat në biologjinë molekulare (Clifton, NJ), 1312, 17–30. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-2694-7_5

[3] Mishra M, Tiwari S, Gomes AV. Pastrimi dhe analiza e proteinave: teknikat e gjeneratës së ardhshme të Western blotting. Expert Rev Proteomics. 2017;14(11):1037-1053. doi:10.1080/14789450.2017.1388167

[4] Kurien BT, Scofield RH. Western blotting. Metodat. 2006;38(4):283-293. doi:10.1016/j.ymeth.2005.11.007

[5] Hnasko TS, Hnasko RM. Western Blot. Metodat Mol Biol. 2015;1318:87-96. doi:10.1007/978-1-4939-2742-5_9