Shërbimi i Shqyrtimit të Bibliotekës së Shfaqjes së Sipërfaqeve të Majave

Alpha Lifetech specializohet në ndërtimin e bibliotekave të shfaqjes së majave dhe shqyrtimin e bibliotekave të antitrupave, duke ofruar mundësinë për të gjeneruar forma të ndryshme të bibliotekave të majave dhe për t'i shqyrtuar ato për afinitet të lartë dhe antitrupa specifikë për klientët në të gjithë botën. Me një ekip studiuesish ekspertë, teknologji dhe pajisje të përparuara, ne mund të ndërtojmë biblioteka majash që synojnë një gamë të gjerë proteinash të lidhura me sëmundjet. Ne mund të ofrojmë teknologji shfaqjeje të fagëve dhe shfaqjeje të majave, duke përfshirë shfaqjen e proteinave në maja, shfaqjen e molekulave të vogla në maja, shfaqjen e antitrupave në maja, etj.

Bibliotekat tona të shfaqjes së majave kanë kapacitet të madh dhe diversitet të lartë, të cilat ofrojnë një bazë të lartë për shqyrtimin efektiv të sekuencave specifike të antitrupave. Ne mund të ndërtojmë forma të ndryshme të bibliotekave të shfaqjes së antitrupave të majave (IgG, scFv, VHH, biblioteka të antitrupave Fab), biblioteka të proteinave, biblioteka të peptideve, biblioteka të ADNc, etj., sipas nevojave tuaja. Përveç kësaj, ne gjithashtu mund të zhvillojmë biblioteka të antitrupave me veti të ndryshme, duke përfshirë biblioteka imune, biblioteka natyrore, biblioteka sintetike, biblioteka gjysmë-sintetike dhe biblioteka të antitrupave të sëmundjeve.

Hyrje në Sistemin e Shfaqjes së Majasë

Teknologjia e shfaqjes në sipërfaqen e majasë është një metodë për shfaqjen e proteinave rekombinante në sipërfaqen e majasë nëpërmjet bashkimit të gjeneve. Sistemi më i zakonshëm i shfaqjes së majasë përdor proteinën e synuar të bashkuar me skajin C të nën-njësisë Aga2p të proteinës çiftëzuese të lektinës alfa, e cila përbëhet kryesisht nga etiketa epitopesh në të dy anët e proteinës së synuar: etiketa hemaglutininë (HA) me 9 aminoacide N-terminale dhe etiketa c-myc me 10 aminoacide C-terminale. Nën-njësia Aga2p me 69 aminoacide lidhet me nën-njësinë Aga1p të lektinës alfa me 725 aminoacide nëpërmjet dy lidhjeve disulfide, dhe Aga1p është e ankoruar në murin qelizor nëpërmjet një lidhjeje kovalente β 1,6-glukan. Prandaj, proteina e synuar shfaqet në sipërfaqen e qelizave të majasë dhe më pas njihet nga ligandi përkatës. Ndani proteinat funksionale nga bibliotekat nëpërmjet shqyrtimit me citometri rrjedhëse.

Fig. 1: Parimi i shfaqjes sipërfaqësore të majasë. (Burimi i figurës: Zbatimet e Ekranit Sipërfaqësor të Majasë për Inxhinierinë e Proteinave.)

Hyrje në Bibliotekën e Shfaqjes së Sipërfaqes së Majasë

Renditja e shfaqjes së majasë bazohet në shfaqjen sipërfaqësore të majasë, e përdorur kryesisht për të shqyrtuar bibliotekat e antitrupave që synojnë proteinat e sipërfaqes qelizore. Për shkak të lidhjes së ulët jo-specifike midis qelizave të majasë dhe sipërfaqeve të tjera qelizore, përzgjedhja biologjike e majasë mund të shqyrtojë biblioteka të mëdha lidhëse për të gjetur klone të rralla.

Shërbimi i Shqyrtimit të Bibliotekës së Shfaqjes së Sipërfaqeve të Majave

Përgatitni plazmidet dhe kultivoni qelizat e majasë, sintetizoni ADN-në që kodon proteinën e synuar dhe klonojeni atë në një vektor shprehjeje të majasë që përmban promotorë të induktueshëm, peptide sinjalizuese dhe gjene të synuara të shkrira me proteinat e shfaqjes sipërfaqësore (siç është Aga2p). Gjeni që kodon proteinën e synuar mund të shkrihet me gjenin që kodon proteinën e murit qelizor të majasë (zakonisht Aga2p), dhe gjeni i shkrirë mund të transformohet në qeliza majaje përmes elektroporimit. Pas transformimit, qelizat e majasë që shprehin gjene antitrupash në sipërfaqen e tyre mund t'i nënshtrohen testeve specifike të shqyrtimit të antigjenit: biblioteka e majasë inkubohet me antigjenin e synuar dhe qelizat e majasë që lidhen posaçërisht me të zgjidhen. Duke përdorur renditjen e qelizave të aktivizuara me fluoreshencë (FACS) për të izoluar qelizat e majasë që shfaqin proteina me karakteristikat e dëshiruara, shqyrtimi i bibliotekës së shfaqjes së majasë mund të kryhet me një madhësi maksimale të bibliotekës prej ~10^8-10^9 qelizash majaje. Klonet pozitive mund të izolohen më pas për analiza të mëtejshme ose aplikime pasuese. Pasi të identifikohen klonet specifike të antitrupave nga biblioteka e antitrupave, ato mund të karakterizohen më tej dhe të prodhohen në masë, dhe të pastrohen duke përdorur teknika të tilla si kromatografia e afinitetit të proteinave A/G për të përfunduar të gjithë procesin e shqyrtimit të shfaqjes së majasë dhe prodhimit të antitrupave.

Procesi i Shqyrtimit të Bibliotekës së Shfaqjes së Majave

Fig. 2 Procesi i shqyrtimit të bibliotekës së shfaqjes së majasë

Fluksi i Punës së Shërbimit të Shqyrtimit të Bibliotekës së Shfaqjes së Majave

Hapat	Përmbajtja e Shërbimit	Kronologjia
Përgatitja e antigjenit	Lloji i antigjenit: Nëse klienti mund të ofrojë antigjene, mostrat përkatëse duhet të dorëzohen sipas llojit: proteinat rekombinante kërkojnë 3-3.5 mg me një kërkesë pastërtie mbi 85%, molekulat e vogla duhet të konjugohen me një kërkesë pastërtie mbi 90%, sinteza e peptideve duhet të konjugohet me një kërkesë pastërtie mbi 90%, llojet e mostrave si viruset duhet të inaktivizohen, ARN-ja duhet të inspektohet për të parandaluar degradimin, dhe llojet e antigjeneve të mësipërme mund të personalizohen gjithashtu për sintezë.	2-3 javë
Imuniteti i kafshëve	Numri i imunizimeve të kafshëve është 5, dhe është e nevojshme të përcaktohet nëse duhet të rritet numri i imunizimeve bazuar në testimin e titrit të serumit. Imuniteti antigjenik: fuqia e antigjenit të proteinës/virusit >105; fuqia e antigjenit të peptideve/molekulave të vogla >10^4	5-6 javë
Përgatitja e shablloneve të ADN-së c	Ndani PBMC-të e plazmës, nxirrni ARN-në totale (kit për nxjerrjen e ARN-së) dhe kthejeni përsëri në ADNc.	1 ditë
Ndërtimi i Bibliotekës	Duke përdorur ADNc-në e bibliotekës si shabllon, gjeni VHH u amplifikua me dy raunde PCR, dhe u ndërtua vektori i shfaqjes së majasë për bashkimin e gjenit VHH. Vektori u transformua në qeliza majaje me anë të elektroporacionit për të ndërtuar një bibliotekë antitrupash. Zgjidhni rastësisht 48 klone dhe identifikoni shkallën pozitive (>90%) duke përdorur metodën PCR; Llogaritni kapacitetin e bibliotekës (10^7-10^8), sekuencimin e NGS për të përcaktuar shkallën e saktë të futjes në bibliotekë (>90%) dhe diversitetin e bibliotekës.	2 javë
Shfaqje në Bibliotekë	Tre raundet e parazgjedhura të shqyrtimit: Shqyrtimi FACS i proteinës së etiketuar me fluoreshencë, i ndjekur nga sekuencimi i NGS në raundin e tretë. Klonet pozitive u përzgjodhën për shprehjen e induksionit të një grami të vetëm dhe zbulimin ELISA. Të gjithë klonet pozitive u përzgjodhën për sekuencimin e gjeneve dhe u përzgjodhën sekuenca të ndryshme të rajonit CDR.	2-3 javë
Verifikimi i Antitrupave	Ndërtimi i vektorëve të përshtatshëm të shprehjes për sekuencat e antitrupave mund të lehtësojë shprehjen e antitrupave, pastrimin e antitrupave, validimin ELISA dhe BLI të lidhjes së antigjenit të antitrupave për të verifikuar afinitetin e antitrupave dhe bllokimin e citometrisë me rrjedhë për të validuar funksionin e qelizave.	1 javë

Rasti i Bibliotekës së Shfaqjes së Sipërfaqes së Majasë

Në literaturën e platformës së shfaqjes sipërfaqësore të majasë për zbulimin e shpejtë të nanotrupave selektivë konformacionalë, autorët krijuan një platformë të plotë zbulimi të nanotrupave in vitro bazuar në shfaqjen sipërfaqësore të majasë. Së pari, u krijua një bibliotekë sintetike e nanotrupave duke filluar nga gjenet e devesë. Figura D tregon se nanotrupi ka një etiketë HA në skajin karboksil, dhe më pas nanotrupi fiksohet në mënyrë kovalente në murin qelizor të majasë. Figura E tregon procesin e shqyrtimit të nanotrupave. Maja me nanotrupa me afinitet antigjeni u izolua, u amplifikua dhe u zgjodh në mënyrë të përsëritur për antitrupa nga FACS. Autorët zbuluan nanotrupa selektivë konformacionalë që synojnë dy GPCR të ndryshëm njerëzorë përmes kësaj platforme.