Платформа за мерење афинитета

Заснован на платформи Оцтет и Биацоре-Т2000, Алпха Лифетецх може пружити поуздане услуге одређивања афинитета. Можемо да обезбедимо одређивање афинитета за више узорака, као што су антитела, ћелије, протеини, мали молекули итд. Постоје различите методе одређивања афинитета, укључујући површинску плазмонску резонанцу (СПР) и одређивање афинитета интерференције био-слоја (БЛИ).

Алпха Лифетецх има професионалну и тачну платформу за одређивање афинитета која комбинује ЕЛИСА са одређивањем афинитета, пружајући професионалне, ефикасне, брзе и прецизне резултате одређивања афинитета за купце широм света. Купцима можемо понудити две методе на избор: брзо одређивање афинитета и прецизно одређивање афинитета. Брзо одређивање афинитета је одређивање једне концентрације, док прецизно одређивање афинитета може мерити афинитет различитих концентрација. Примењује се на проучавање интеракција између различитих једињења малих молекула, пептида, протеина, олигонуклеотида и олигомера, као и липида, бактериофага, вируса и ћелија. Платформа за мерење афинитета може да постави основу за тестирање и скрининг лекова афинитета, откривање антитела и олакша накнадно истраживање.

Увод у Биндинг Аффинити

Афинитет је важан у процени интермолекуларних интеракција, тестовима афинитета лекова и скринингу лекова. Интермолекуларне интеракције се могу описати једначинама: Л + Р = ЛР, где Л представља слободне лиганде, Р представља невезане рецепторе, а ЛР представља везане комплексе лиганд-рецептор. Реакције везивања дефинишу међумолекулске интеракције, где се дешава динамичка размена између везаних и невезаних стања током реакције док се не постигне равнотежа. Ово се може описати са две константе брзине, Кон (константа брзине везивања) и Кофф (константа брзине дисоцијације), реакције. Вредност Кд, која је реципрочна константа везивања (Ка), је Кофф/Кон, важна константа за афинитет реакције. Стога, што је чвршће везивање између два молекула, то је већи афинитет. Што је мања вредност Кд, обрнуто. Ова једначина се може представити као крива у облику слова С на полулогаритамском графику, са концентрацијом лиганда на к-оси (на оси логаритамске скале) и фракционом границом на и-оси. Испрекидана линија представља концентрацију лиганда на Кд (1 нМ) од 0,5 везујуће фракције.

Слика 1: Сигмоидна крива везивања различитих концентрација лиганда везаног за рецептор на површини ћелије. (Референтни извор:Хунтер СА, Цоцхран ЈР. Тестови везивања ћелија за одређивање афинитета интеракција протеин-протеин: технологије и разматрања.)

Методе за одређивање афинитета

ЕЛИСА тест афинитета везивања

Широко коришћена техника за проучавање афинитета антитела заснива се на ЕЛИСА методи, коју карактерише практичност, брзина, једноставност, висока осетљивост и јака специфичност. Може да користи малу количину реагенаса (тј. антитела и антигена) и мери афинитет антитела без потребе за реагенсима за пречишћавање. Имобилизацијом антигена на чврстој површини и откривањем помоћу примарног антитела, обележено секундарно антитело реагује са примарним антителом да би прочитало и анализирало податке у читачу за ензимски имуносорбентни тест (ЕЛИСА).

Слика 2: Тестови слични ЕЛИСА за процену везивања дизајнираних пептида за њихове мете. ( Извор референце:Хајикаримлоу, Мариам, ет ал., 2022. Рачунски приступ за брзо дизајнирање пептида који детектују САРС-ЦоВ-2 површински протеин С.)

Тест афинитета везивања површинске плазмонске резонанце (СПР).

СПР технологија углавном детектује промене индекса преламања. Уз помоћ традиционалних оптичких феномена и резонантног феномена светлости, технологија анализе биосенсинга за интеракцију између биомолекула може бити конструисана да би се открила интеракција између лиганада и аналита на биосенсинг чиповима. Специфични сигнали везивања и интеракције између биомолекула могу се добити праћењем динамичких промена углова СПР током биолошких реакција.

Слика 3: Анализа површинске плазмонске резонанце (СПР) везивања Х10/АГР2. (Референтни извор:Гарри, Царолина, ет ал., 2018. Идентификација, карактеризација и примена новог пептида против хомолога предњег градијента 2 (АГР2).)

Био Лаиер Интерференце (БЛИ) тест афинитета везивања

Технологија интерференције биофилма је техника оптичке детекције за праћење у реалном времену без етикете која се углавном користи за свеобухватну квантитативну анализу међумолекуларних интеракција и одређивање концентрације протеина. Ова технологија користи биосензор заснован на сонди да директно детектује промене у дебљини биофилма на узорку. Откривањем промена померања спектра интерференције, детектује се везивање и дисоцијација између биомолекула који интерагују на површини сензора и приказује се померање спектра интерференције у реалном времену (нм).

Слика 4: Тест интерферометрије биослоја (БЛИ) између аЛДРГ и хитинолигосахарида. (Референтни извор:Ли, Бинг, 2023. Ознаке компаративног транскриптома између ризоморфа и хифа Армиллариа сп. 541 Учешће у симбиози гљивица са нагласком на ЛисМ доменима.)

Поређење БЛИ и СПР технологије

Назив технологије	БЛИ (Био-Лаиер Интерферометрија)	СПР (површинска плазмонска резонанца)
Принцип	Мери промене у обрасцу интерференције рефлектоване светлости на површини сензора, детектујући молекуларне интеракције преко промена у оптичкој дебљини на био-слоју. Обезбеђује криву везивања у реалном времену (директно мерење).	Мери молекуларне интеракције откривањем промена сигнала у индексу преламања у близини површине сензорског чипа (јавља се када светлост ступи у интеракцију са сучељем злата и стакла, изазивајући промене у индексу преламања). Подаци се рефлектују као промене угла резонанције (индиректно мерење).
Произвођач	Сарториус	ГЕ
Инструмент	ФортеБио биосензори	Отворите СПР инструмент
Систем	ФортеБио октет систем (за анализу молекуларне интеракције)	ТрацеДравер (развио Ридгевиев Инструментс, Шведска)
Предности	1. Широка компатибилност узорка, одлична стабилност, посебно за детекцију малих молекула (специфични захтеви за чистоћу узорка и услове пуфера су мање строги). ССА чипови су исплативи за студије везивања. 2. Бржи проток и краће експериментално време у поређењу са СПР.	1. Дужа историја развоја, нуди већу осетљивост у поређењу са БЛИ. 2. Већа прецизност и робусност за специфичне примене, као што је откривање ретких или вредних протеина са вишим подацима о афинитету и специфичности.
Недостаци	1. Прецизност података нешто нижа у поређењу са СПР. 2. Захтева пажљиво одржавање инструмента. 3. Цена ССА чипа је релативно висока.	1. Услови пуфера за детекцију веома малих молекула могу бити захтевни, повећавајући ризик од неуспеха детекције. 2. Чипови су генерално скупљи од оних који се користе у БЛИ. 3. Испаравање узорка током продужених експеримената може бити проблем.
Тип чипа	ССА Цхип	НТА Цхип

Обим мерења афинитета

Одређивање афинитета може укључити антиген-антитело (јако антиген-антитело, слабо антиген-антитело), протеин-протеин, протеин-пептид, протеин-мали молекул и протеин ДНК/РНА (аптамер). Приликом мерења КД потребно је знати једну од моларних концентрација. Када се вежу мали молекули, једна молекулска тежина не може бити мања од 150 далтона.

Тип	Обим	Превентивне мере
1. Антиген-антитело	10^-6 до 10^-12	Вредности Кд већине антитела су у опсегу од 10^-6-10^-7 до 10^-9. Генерално се верује да су антитела високог афинитета унутар 10^-9, док су високог афинитета. Антитела су унутар 10^-12.
2. Протеини – мали молекули	10^-4 до 10^-5	КД малих молекула и протеина је између 10^-4 и 10^-5, док су 10^-3 и 10^-7 нормални и не могу достићи 10^-10. Ковалентни мали молекули могу достићи 10^-10.
3. Авидин-Биотин	10^-14	Афинитет се лако може подвргнути неспецифичном везивању, а може се користити стрептавидин или дегликозиловани афинитет.
4. ДНК-протеин	10^-8 до 10^-10	Висок квалитет и комплетан ДНК; пазите да спречите утицај електрофорезе.

Захтеви за узорке за одређивање афинитета

Узорак	Захтеви
1. Узорак великог молекула	Протеини > 50 µг, антитело > 100 µг, биотиниловани протеин > 200 µг; протеин без биотина > 2 мг, захтев за чистоћом > 90%, пуферски раствор: ПБС, ХЕПБС. Не може да садржи имидазолне групе; потребна је контрола квалитета.
2. Узорак малог молекула	Количина>1мг, прах или течност, течност мора бити растворљива у води или ДМСО. Покушајте да не садржи глицерол, имидазол, трехалозу или друге соли; покушајте да избегнете реагенсе са амино групама као што је Трис у пуферу, углавном ПБС, ХЕППС, итд. без органских реагенса.

Предности платформе за мерење афинитета

Анализа вишеструких узорака

Алпха Лифетецх може да обезбеди тестове афинитета за различите узорке, укључујући антитела, ћелије, протеине и друге биомолекуле.

Зрела технолошка платформа

Имамо напредне технологије као што су тест везивања спр, тест везивања бли и тест везивања елиса.

Флексибилан избор пројекта

Купци могу да бирају између брзог одређивања афинитета и прецизног одређивања афинитета.

Резултати високе прецизности

Наш професионални технички тим може да обезбеди ефикасне, тачне и поуздане резултате одређивања афинитета.

Студија случајаЦАСЕ

БЛИ брзи тест афинитета антитела и тест афинитета аптамера

Ухватите биотиниловане аптамере са специфичношћу СА сонде и растворите их. Растворити и разблажити узорак до фиксне концентрације, учврстити ухваћене циљне 1-5 аптамере специфичне за сонду и након засићења сигнала, везати се за узорак. Затим их додајте у плочу са 96 јажица.

Слика 5: Расподела позиција детекције за узорке плоча са 96 бунарчића. Б се односи на бафер који се користи за балансирање и дисоцијацију сензора. Л: Биотин Циљ 1-5 аптамера, 221: Узорак.

Обратите пажњу на бушење како бисте осигурали стабилност и тачност података и подесите одговарајући програм да бисте добили резултате:

Слика 6: Дијаграм уклапања интеракције између циљних 1, 2 и 3 аптамера и узорака. (ЦХ 1 \ 3 \ 5 представља сигнал и податке о интеракцији између очврсле сонде Таргет 1 \ 2 \3 аптамера и узорка.)

Слика 7: Дијаграм уклапања интеракције између циљних 4 и 5 аптамера и узорака. (ЦХ 1 \ 3 представља сигнал и податке о интеракцији између очврснуте Таргет 4 \ 5 аптамер сонде и узорка.)

резултати показују

Добијени су следећи резултати: Афинитет Таргет 1 адаптера према узорку након уклапања био је 9,41 ^ -8; афинитет Таргет 2 адаптера према узорку након уклапања је 8,32 ^ -8; афинитет Таргет 3 адаптера према узорку након уклапања је 8,64 ^ -8; афинитет Таргет 4 адаптера према узорку након уклапања је 3,70 ^ -8; афинитет Таргет 5 адаптера према узорку након уклапања је 3,01 ^ -8.

Ако имате било каквих питања, слободно нас контактирајте у било које време.

Leave Your Message

Феатуред Сервице

0102