Платформа за мерење афинитета

На основу платформи Octet и Biacore-T2000, Alpha Lifetech може да пружи поуздане услуге одређивања афинитета. Можемо да обезбедимо одређивање афинитета за више узорака, као што су антитела, ћелије, протеини, мали молекули итд. Постоје различите методе одређивања афинитета, укључујући одређивање афинитета помоћу површинске плазмонске резонанце (SPR) и интерференције био-слоја (BLI).

Алфа Лајфтек има професионалну и прецизну платформу за одређивање афинитета која комбинује ELISA са одређивањем афинитета, пружајући професионалне, ефикасне, брзе и прецизне резултате одређивања афинитета за купце широм света. Можемо понудити две методе које купци могу изабрати: брзо одређивање афинитета и прецизно одређивање афинитета. Брзо одређивање афинитета је одређивање једне концентрације, док прецизно одређивање афинитета може мерити афинитет различитих концентрација. Примењује се на проучавање интеракција између различитих једињења малих молекула, пептида, протеина, олигонуклеотида и олигомера, као и липида, бактериофага, вируса и ћелија. Платформа за мерење афинитета може поставити темеље за тестирање и скрининг афинитета лекова, откривање антитела и олакшати накнадна истраживања.

Увод у афинитет везивања

Афинитет је важан у процени интермолекуларних интеракција, афинитетних тестова лекова и скрининга лекова. Интермолекуларне интеракције могу се описати једначинама: L + R = LR, где L представља слободне лиганде, R представља невезане рецепторе, а LR представља везане комплексе лиганд-рецептор. Реакције везивања дефинишу интермолекуларне интеракције, где се динамичка размена одвија између везаног и невезаног стања током реакције док се не постигне равнотежа. Ово се може описати помоћу две константе брзине, Kon (константа брзине везивања) и Koff (константа брзине дисоцијације), реакције. Вредност Kd, која је реципрочна вредност константе везивања (Ka), је Koff/Kon, важна константа за афинитет реакције. Стога, што је чвршће везивање између два молекула, то је већи афинитет. Што је мања вредност Kd, то је обрнуто. Ова једначина се може представити као крива у облику слова S на полулогаритамском графику, са концентрацијом лиганда на x-оси (на логаритамској оси скале) и фракционом границом на y-оси. Испрекидана линија представља концентрацију лиганда при Kd (1 nM) од 0,5 фракције везивања.

Слика 1: Сигмоидна крива везивања различитих концентрација лиганда везаног за рецептор на површини ћелије. (Извор референце: Хантер СА, Кокран ЈР. Тестови везивања ћелија за одређивање афинитета протеин-протеин интеракција: Технологије и разматрања.)

Методе за одређивање афинитета

ELISA тест афинитета везивања

Широко коришћена техника за проучавање афинитета антитела заснива се на ELISA методи, коју карактерише погодност, брзина, једноставност, висока осетљивост и јака специфичност. Може да користи малу количину реагенса (тј. антитела и антигена) и да мери афинитет антитела без потребе за реагенсима за пречишћавање. Имобилизацијом антигена на чврстој површини и његовом детекцијом помоћу примарног антитела, обележено секундарно антитело реагује са примарним антителом како би се очитали и анализирали подаци у читачу за ензимски повезани имуносорбентни тест (ELISA).

Слика 2: Тестови слични ELISA-и за процену везивања дизајнираних пептида за њихове циљеве. (Извор референце: Хаџикаримлу, Марјам и др., 2022. Рачунарски приступ за брзо дизајнирање пептида који детектују површински протеин S SARS-CoV-2.)

Тест афинитета везивања површинске плазмонске резонанције (SPR)

SPR технологија углавном детектује промене индекса преламања. Уз помоћ традиционалних оптичких феномена и резонантног феномена светлости, може се конструисати технологија биосензорске анализе интеракције између биомолекула како би се детектовала интеракција између лиганда и аналита на биосензорским чиповима. Специфични сигнали везивања и интеракције између биомолекула могу се добити праћењем динамичких промена SPR углова током биолошких реакција.

Слика 3: Анализа везивања H10/AGR2 помоћу површинске плазмонске резонанције (SPR). (Извор референце: Гари, Каролина и др., 2018. Идентификација, карактеризација и примена новог пептида против предњег градијентног хомолога 2 (AGR2).)

Тест афинитета везивања за био-слојну интерференцију (BLI)

Технологија интерференције биофилма је оптичка техника детекције у реалном времену без обележавања која се углавном користи за свеобухватну квантитативну анализу интермолекуларних интеракција и одређивање концентрације протеина. Ова технологија користи биосензор заснован на сонди за директно детектовање промена у дебљини биофилма на узорку. Детекцијом промена померања спектра интерференције, детектује се везивање и дисоцијација између биомолекула који интерагују на површини сензора и приказује се померање спектра интерференције у реалном времену (нм).

Слика 4: Тест биослојне интерферометрије (BLI) између aLDRG и хитинолигосахарида. (Извор референце: Ли, Бинг, 2023. Обележја упоредног транскриптома између ризоморфа и хифа врсте Armillaria sp. 541 Учешће у гљивичној симбиози са нагласком на LysM домене.)

Поређење BLI и SPR технологије

Назив технологије	BLI (Био-слојна интерферометрија)	SPR (Површинска плазмонска резонанца)
Принцип	Мери промене у интерференцијском обрасцу рефлектоване светлости на површини сензора, детектујући молекуларне интеракције путем промена у оптичкој дебљини био-слоја. Обезбеђује криву везивања у реалном времену (директно мерење).	Мери молекуларне интеракције детекцијом промена сигнала у индексу преламања близу површине сензорског чипа (долази када светлост интерагује са златном и стакленом интерфејсом, узрокујући промене у индексу преламања). Подаци се одражавају као промене у углу резонанције (индиректно мерење).
Произвођач	Сарторијус	ГЕ
Инструмент	ForteBio биосензори	Отворени SPR инструмент
Систем	ForteBio Octet System (за анализу молекуларних интеракција)	TraceDrawer (развијен од стране Ridgeview Instruments, Шведска)
Предности	1. Широка компатибилност са узорцима, одлична стабилност, посебно за детекцију малих молекула (специфични захтеви за чистоћу узорка и услове пуфера су мање строги). SSA чипови су исплативи за студије везивања. 2. Бржи проток и краће експериментално време у поређењу са SPR.	1. Дужа историја развоја, што нуди већу осетљивост у поређењу са BLI. 2. Већа прецизност и робусност за специфичне примене, као што је откривање ретких или вредних протеина са већим афинитетом и специфичношћу података.
Недостаци	1. Прецизност података је нешто нижа у поређењу са SPR-ом. 2. Захтева пажљиво одржавање инструмента. 3. Цена SSA чипа је релативно висока.	1. Пуферски услови за детекцију веома малих молекула могу бити захтевни, што повећава ризик од неуспеха детекције. 2. Чипови су генерално скупљи од оних који се користе у BLI. 3. Испаравање узорка током продужених експеримената може бити проблем.
Тип чипа	SSA чип	НТА чип

Обим мерења афинитета

Одређивање афинитета може обухватити антиген-антитело (јако антиген-антитело, слабо антиген-антитело), протеин-протеин, протеин-пептид, протеин-мали молекул и протеин ДНК/РНК (аптамер). При мерењу KD, неопходно је знати једну од моларних концентрација. Када се везују мали молекули, једна молекулска маса не може бити мања од 150 далтона.

Тип	Обим	Превентивне мере
1. Антиген-антитело	10^-6 до 10^-12	Kd вредности већине антитела су у опсегу од 10^-6-10^-7 до 10^-9. Генерално се сматра да су антитела са високим афинитетом унутар 10^-9, док су антитела са високим афинитетом унутар 10^-12.
2. Протеини - мали молекули	10^-4 до 10^-5	KD малих молекула и протеина је између 10^-4 и 10^-5, док су 10^-3 и 10^-7 нормални и не могу достићи 10^-10. Ковалентни мали молекули могу достићи 10^-10.
3. Авидин-Биотин	10^-14	Афинитет може лако да се веже неспецифично, а може се користити стрептавидин или дегликозиловани афинитет.
4. ДНК-протеин	10^-8 до 10^-10	Висококвалитетна и комплетна ДНК; пазите да спречите утицај електрофорезе.

Захтеви за узорке за одређивање афинитета

Узорак	Захтеви
1. Узорак великог молекула	Протеин > 50 µг, антитело > 100 µг, биотиниловани протеин > 200 µг; протеин без биотина > 2 мг, захтев за чистоћу > 90%, пуферски раствор: PBS, HEPBS. Не сме да садржи имидазолне групе; потребна је контрола квалитета.
2. Узорак малог молекула	Количина >1 мг, прах или течност, течност мора бити растворљива у води или ДМСО. Покушајте да не садржи глицерол, имидазол, трехалозу или друге соли; покушајте да избегавате реагенсе са амино групама као што је Трис у пуферу, генерално ПБС, ХЕППС итд. без органских реагенса.

Предности платформе за мерење афинитета

Анализа више узорака

Алфа Лајфтек може да обезбеди афинитетне тестове за различите узорке, укључујући антитела, ћелије, протеине и друге биомолекуле.

Зрела технолошка платформа

Имамо напредне технологије као што су тест везивања spr, тест везивања bli и тест везивања ELISA.

Флексибилан избор пројекта

Купци могу бирати између брзог одређивања афинитета и прецизног одређивања афинитета.

Резултати високе прецизности

Наш професионални технички тим може да обезбеди ефикасне, тачне и поуздане резултате одређивања афинитета.

Студија случајаСЛУЧАЈ

BLI брзи афинитетни тест антитела и тест афинитета аптамера

Ухватите биотинилисане аптамере са специфичношћу SA сонде и растворите их. Растворите и разблажите узорак до фиксне концентрације, учврстите специфичне за сонду ухваћене аптамере Target 1-5 и, након засићења сигнала, вежите се за узорак. Затим их додајте на плочу са 96 бунарића.

Слика 5: Дистрибуција позиција детекције за узорке плоче са 96 бунарића. Б се односи на пуфер који се користи за балансирање и дисоцијацију сензора. Л: Биотин циљни аптамери 1-5, 221: Узорак.

Обратите пажњу на бушење како бисте осигурали стабилност и тачност података и подесите одговарајући програм да бисте добили резултате:

Слика 6: Дијаграм уклапања интеракције између аптамера Target 1, 2 и 3 и узорака. (CH 1 \ 3 \ 5 представља сигнал и податке интеракције између очврснуте сонде аптамера Target 1 \ 2 \ 3 и узорка.)

Слика 7: Дијаграм уклапања интеракције између аптамера Target 4 и 5 и узорака. (CH 1 \ 3 представља сигнал и податке интеракције између очврснуте сонде аптамера Target 4 \ 5 и узорка.)

резултати показују

Добијени су следећи резултати: Афинитет адаптера Target 1 према узорку након уклапања био је 9,41 ^ -8; афинитет адаптера Target 2 према узорку након уклапања је 8,32 ^ -8; афинитет адаптера Target 3 према узорку након уклапања је 8,64 ^ -8; афинитет адаптера Target 4 према узорку након уклапања је 3,70 ^ -8; афинитет адаптера Target 5 према узорку након уклапања је 3,01 ^ -8.

Ако имате било каквих питања, слободно нас контактирајте у било ком тренутку.

Leave Your Message

Истакнута услуга

0102