Истраживачка служба Аптамера
У складу са различитим потребама купаца за анализом, Алфа Лајфтех нуди разне стратегије анализе аптамера које купци могу да изаберу.
КОНТАКТИРАЈТЕ НАС01
Истраживачка служба Аптамера
Увод у аптамер
Аптамери су молекули једноланчане нуклеинске киселине (као што су ДНК или РНК) који се ин витро скринира из библиотеке синтетичких олигонуклеотида са насумично додељеним секвенцама процесом који се назива SELEX скрининг, који укључује више рунди итеративне селекције. Главне компоненте услуга развоја аптамера у власништву компаније Alpha Lifetech укључују изградњу библиотеке аптамера, SELEX скрининг аптамера, SELEX секвенцирање аптамера, анализу секвенце аптамера и друге анализе аптамера.
SELEX секвенцирање комбинује SELEX скрининг аптамера и секвенцирање високог протока. Кроз SELEX секвенцирање аптамера, специфична секвенца аптамера везаног за циљ може се ефикасно одредити, пружајући основне податке за каснију анализу и примену секвенце аптамера.
Аптамери се широко користе у научним истраживањима, лечењу болести, конструисању биосензора, откривању лекова и праћењу животне средине. Међутим, олигонуклеотидни аптамери тестирани in vitro лако су се разградили in vivo, па чак и показали токсичност. Стога је, након оптимизације тестираних аптамера, потребна in vitro анализа како би се проценио успех развоја аптамера. У складу са различитим потребама купаца за анализом, Alpha Lifetech нуди разне стратегије анализе аптамера које купци могу да изаберу.
Сл.1 Дијаграм анализе аптамера. Извор референце:Тевендран Р, Цитартан М. 2022. Тестови за процену афинитета везивања аптамера.
Увод у службу истраживања аптамера
Анализа стабилности аптамера
Експеримент разградње нуклеаза
Инкубацијом аптамера са различитим типовима нуклеаза (као што су ДНаза, РНаза итд.) под специфичним условима, посматра се деградација аптамера, како би се проценила његова способност спречавања деградације. Ово је корисно за одређивање стабилности и трајности аптамера у практичним применама.
Метода флуоресцентног обележавања
Стабилност аптамера се процењује индиректно обележавањем флуорофора на аптамеру и посматрањем промена флуоресцентног сигнала пре и после везивања са циљем. На пример, када се аптамер веже за циљ, његова конформација се може променити, што резултира појачаним или смањеним флуоресцентним сигналом.
Анализа термичке стабилности
Термичка стабилност аптамера се процењује мерењем промене његове температуре топљења (Tm вредности) на различитим температурама. Што је температура топљења аптамера виша, то је његова термичка стабилност боља.
Анализа динамичке стабилности
Површинска плазмонска резонанца (SPR) и друге технологије коришћене су за праћење процеса везивања и раздвајања између аптамера и мете у реалном времену, добијање динамичких параметара (као што су константа брзине везивања, константа брзине дисоцијације итд.), даље разумевање механизма интеракције између аптамера и мете и процену његове динамичке стабилности.
Анализа структурне стабилности
За анализу тродимензионалне структуре аптамера и његове структурне стабилности коришћене су рендгенска кристалографија, нуклеарна магнетна резонанца (НМР) и друге технике структурне биологије.
Аптамер специфична анализа
Тест везивања аптамера
Афинитет се процењује спровођењем теста везивања аптамера како би се измерила константа везивања између аптамера и циљног молекула, као што је константа дисоцијације Kd. Нижа вредност Kd указује на већи афинитет. Тест везивања аптамера може да елиминише кандидате за лекове са високом способношћу везивања, а затим да спроведе накнадне фармакодинамске и фармакокинетске студије.
Експеримент обрнутог скрининга
Тест реверзног скрининга је метода скрининга за брзо искључивање нециљних молекула из великог броја кандидатских молекула. Реверзни скрининг је осмишљен да искључи молекуле који немају ово својство или функцију. Кључ реверзног скрининга је одабир одговарајућих маркера или услова реверзног скрининга који омогућавају идентификацију и уклањање нециљних молекула током процеса скрининга. У овом експерименту, одабир нециљних молекула је веома важан. Треба осигурати да су одабрани нециљни молекули репрезентативни за супстанце које могу ометати скрининг аптамера и да су могући фактори ометања што је више могуће покривени.
Експеримент конкурентне инхибиције
Додавањем прекомерних конкурената (као што су молекули сличне структуре као циљни молекул) у систем везивања аптамера и циљног молекула, примећује се промена способности везивања аптамера и циљног молекула. Ако је способност аптамера да се веже за циљни молекул значајно смањена, то указује да аптамер има високу специфичност.
У неким случајевима, експерименти компетитивне инхибиције могу се користити као део или као додатак експериментима обрнутог скрининга. На пример, у процесу скрининга лекова, способност молекула лека да се веже за циљни протеин може се проценити експериментима компетитивне инхибиције, а затим се експерименти обрнутог скрининга могу користити за уклањање оних једињења која су превише јако везана за нормалне ћелије или ткива.
Анализа цитотоксичности аптамера
Постоји низ експерименталних метода за анализу цитотоксичности аптамера, које су дизајниране да процене ефекте аптамера на преживљавање, пролиферацију или функцију ћелија.
| Методе | Детаљан увод | Предност | Недостатак |
|---|---|---|---|
| Метода детекције МТТ | МТТ тест је метода заснована на ензимској активности у митохондријама живих ћелија. Сукцинат дехидрогеназа у митохондријама живих ћелија може редуковати егзогени МТТ до плаво-љубичастог кристала формазана нерастворљивог у води и депоновати га у ћелији, док мртве ћелије немају такву функцију. Растварање ових кристала диметил сулфоксидом (ДМСО) и детекција апсорбанције на одређеним таласним дужинама (као што су 490 нм или 570 нм) на ензимометру може индиректно одразити број живих ћелија и тако проценити цитотоксичност аптамера. | Висока осетљивост, економичност и практичност | Велико оптерећење, органски растварачи могу оштетити ћелије; могу се добити само коначни експериментални резултати и не може се сагледати комплетан процес цитотоксичности. |
| Метода детекције CCK-8 | Комплет за бројање ћелија 8 (CCK-8) је високо осетљива, нерадиоактивна колориметријска метода детекције. CCK-8 садржи WST-8, који се редукује дехидрогеназом у митохондријама живих ћелија да би се произвело високо водорастворљиво наранџасто метил зан гориво. Количина произведене мезан боје је линеарно повезана са бројем живих ћелија, а број живих ћелија се може индиректно одразити мерењем вредности апсорпције светлости Мезан боје на таласној дужини од 450 nm, како би се проценила цитотоксичност аптамера. | Једноставно руковање, нема потребе за прањем ћелија, брза детекција, широк линеарни опсег детекције, висока осетљивост, добра поновљивост, мала цитотоксичност | Висока цена реагенса; Понекад је тешко рећи да ли је смањена апсорбанција последица смањења броја живих ћелија или смањења активности саме ћелијске дехидрогеназе. |
| Метода детекције ЛДХ | ЛДХ (лактат дехидрогеназа) је ензим који је стабилан у цитоплазми ћелија, а када је ћелијска мембрана оштећена, ЛДХ се ослобађа ван ћелије. ЛДХ може катализовати млечну киселину да би се формирао пируват и реаговати са ИНТ (тетразолијум солима) да би се формирала љубичаста кристална супстанца. Мерењем његове апсорбанције на одређеној таласној дужини (као што је 490 нм), може се одразити степен оштећења ћелија, а затим се може проценити цитотоксичност аптамера. | Директно одражава стопу смртности ћелија и има мање оштећења ћелија, а нема контаминације радиоактивним изотопима. | Потреба за честим вађењем ћелија из инкубатора, операција је компликованија; могу се добити само коначни експериментални резултати, а не може се сагледати комплетан процес цитотоксичности. |
| Анализа снимања ћелија у реалном времену | Користећи анализатор снимања живих ћелија у реалном времену, инструмент је смештен у инкубатор како би се посматрао и снимао цео процес циклуса раста ћелија у реалном времену. Цитотоксичност аптамера може се проценити анализом морфолошких промена и кривих раста ћелија. Ова метода може да пружи видео и квантификоване резултате цитотоксичних процеса, уз одржавање стабилног окружења за раст ћелија. | Може да прати цитотоксични процес у реалном времену, недеструктивним снимањем, смањује сметње и оштећење ћелија; И видео и квантификовани резултати су доступни за детаљну анализу. | Трошкови опреме су високи и захтевају професионалне вештине рада и способност анализе података. |
КАЦХИ
Предност истраживачке службе Аптамер
Тотална контрола квалитета
Оптимизовани аптамери са већом стабилношћу
Економично и ефикасно. Конкурентнија цена, боља услуга
Свеобухватна истраживачка места и вишеструке методе истраживања
Професионалне консултације пре продаје и постпродајне услуге подршке
Богато искуство у анализи аптамера
Тим за истраживање и развој високог нивоа
Прилагођене услуге везане за аптамере
Ако имате било каквих питања, слободно нас контактирајте у било ком тренутку.
Leave Your Message
16.07.2018. 
0102