Служба за развој моноклонских антитела

Алфа Лајфтек може да обезбеди предвиђање епитопа, синтезу пептида, експресију протеина, производњу поликлонских или моноклонских антитела, као и пречишћавање антитела из ћелијске културе, асцитне течности или целог серума.

КОНТАКТИРАЈТЕ НАС

Служба за развој моноклонских антитела

Алфа Лајфтек Инк.може да обезбеди предвиђање епитопа, синтезу пептида, експресију протеина, производњу поликлонских или моноклонских антитела, као и пречишћавање антитела из ћелијске културе, асцитне течности или целог серума.

Алфа Лајфтек Инк.има искуства у пружању клијентима разних услуга стабилних ћелијских линија, укључујући хибридомске ћелије, ћелијске линије за уређивање генома, ћелијске линије са нокдауном и ћелијске линије са прекомерном експресијом. Трудимо се да сваком клијенту понудимо напредне услуге прилагођених ћелијских линија, а наше услуге су доказане и поуздане.

Стратегија развоја антитела

1. Дизајн и припрема антигена
Ови антигени могу бити протеини, пептиди или други молекули. Дизајнирање имуногена захтева свеобухватан приступ који интегрише знање о структури антигена, имунологији и системима испоруке. Алфа Лајфтек поседује технологију дизајнирања антигена која може да дизајнира имуногене за купце којима је то потребно.
Алфа Лајфтек нуди купцима производе рекомбинантних протеина. Имамо разне системе за експресију протеина, као што су систем за експресију E. coli, систем за експресију квасца, систем за експресију бакуловируса и инсеката, систем за експресију сисара итд., за производњу рекомбинантних протеина који су вам потребни за истраживање.

2. Имунизација животиња
Алфа Лајфтек може да обезбеди имуногене купцима, а имуне животиње као што су мишеви, зечеви, овце, алпаке, заморци, хрчци итд. су вам доступне да бирате.

3. Методе производње моноклонских антитела

●Производња Mabs хибридомском технологијом
Хибридом је хибридна ћелија произведена фузијом две врсте ћелија, наиме ћелијске линије мишјег мијелома и плазма ћелија (лимфоцит Б), у којој хетерозиготна ћелија може да производи континуирана антитела против антигена од интереса in vitro. Производња ћелијске линије хибридома састоји се од три дела: дизајна антигена (хаптена, малих молекула и пептида), имунизације животиња, фузије ћелија и скрининга позитивних клонова. Користећи јединствене методологије имунизације, постижемо изузетно високу ефикасност ћелијске фузије (1-10 хибридома на хиљаду Б ћелија) и високе титре антитела, максимизирајући нашу стопу успеха у накнадним аналитичким тестовима који укључују биохемијски скрининг, in vitro тестове на бази ћелија и студије на животињама.

●Производња моноклоналних антитела помоћу технологије фагног приказа
Фагни дисплеј нуди још једну методу за генерисање моноклонских антитела. Б-лимфоцити се изолују из животињске крви и њихова иРНК се екстрахује. Путем ПЦР-а, ова иРНК се конвертује у цДНК, која амплификује све VH и VL сегменте. Ови сегменти се затим клонирају у вектор, обично као једноланчани варијабилни фрагменти (scFv), заједно са PIII протеином бактериофага. Након тога, ова конструкција се користи за инфекцију E. coli, што резултира стварањем библиотеке која садржи приближно 10^10 ћелија путем инокулације са помоћним фагом. E. coli је тада у стању да лучи бактериофаг који садржи VH и VL сегменте као део свог омотача. Након тога, специфични VH и VL сегменти који циљају антиген од интереса могу се одабрати и користити за реинокулацију E. coli бактериофагом. Ћелије које садрже плазмид се затим изолују и секвенцирају.

4. Скрининг фузије

●Фузија и селекција ћелија
Сакупљене Б ћелије се затим спајају са ћелијама мијелома, које су канцерогене ћелије које се могу неограничено размножавати у култури. Фузија се обично постиже техником као што је фузија полиетилен гликола (PEG).
Након фузије, хибридомске ћелије се култивишу у селективној подлози која омогућава преживљавање само хибридома. Подлога обично садржи аминоптерин, који спречава раст нефузованих мијеломских ћелија.

●Скрининг и клонинг
Добијене хибридомске ћелије се тестирају на производњу антитела специфичних за циљни антиген. То се обично ради коришћењем техника као што су ензимски имуносорбентни тест (ELISA), Western blot, имунопреципитација и проточна цитометрија.

Када се идентификују хибридомске ћелије које производе антитело, оне се клонирају да би се генерисала популација идентичних ћелија. Ово осигурава да је антитело које производи свака хибридомска ћелија идентично.

5. Верификација функционалности антитела
Алфа Лајфтек пружа функционалну валидацију антитела, као што су Вестерн блотинг, имунохистохемија или функционални тестови, како би се окарактерисала моноклонска антитела и потврдила специфичност, афинитет и функционалност антитела.

6. Оптимизација антитела
Пречишћавање антитела из супернатанта културе коришћењем техника као што су афинитетна хроматографија протеина А или протеина Г, а Алфа Лајфтех такође може да обезбеди методе модификације антитела ради побољшања афинитета антитела.

7. Производња антитела
Алфа Лајфтек може да процени кандидатска антитела за примене високог протока и производњу великих размера.

честа питањачеста питања

Најчешћа питања о развоју моноклонских антитела

1

Како одабрати прави фузиони хибридом?

Током процеса фузије, 10-15 микротитарских плоча са 96 бунарића се засејава смешом фузионих хибрида. Свака плоча се храни HAT-IMDM селекционим медијумом и одржава у инкубатору са угљен-диоксидом на 37 степени Целзијуса. 9-14 дана након фузије, хибридни супернатанти се тестирају на присуство специфичног антитела од интереса.
2

Како побољшати ефикасност селекције?

Фузија плазма ћелија са њиховим мијеломским панданима није 100% ефикасна. Чак и под оптималним условима и најефикаснијом стимулацијом, ћелијска фузија и даље производи мешавину неконфлуентних и конфлуентних ћелија које је потребно раздвојити. Да би се побољшала ефикасност процеса селекције, мијеломским ћелијама које се користе за фузију недостаје HGPRT, кључни ензим у путу спасавања нуклеотида. Смеша је затим култивисана у HAT медијуму, где су само ћелије са HGPRT ензимом, хибридоми који су наследили HGPRT од плазма ћелија, биле одрживе.
3

Како скринирати ћелијске линије хибридома на активност антитела?

Евалуација хибридних сорти је кључни корак. Обично се скрининг супернатанта хибридома, клонова и субклонова врши путем ензимски повезаног имуносорбентног теста (ELISA), Western blot теста и сортирања ћелија активираних флуоресценцијом (FACS). Одабраћемо да спроводимо сав скрининг супернатанта у нашој сопственој лабораторији.
4

Да ли треба дати детаљна упутства о томе како да се спроведе скрининг активности антитела?

Хибридомски супернатанти који ће бити тестирани могу се кретати од 500 до 1.440 узорака и биће спремни за тестирање од 9. до 14. дана. Можемо настати у периоду од три до пет дана или сви можемо бити спремни истог дана, тако да је важно да клијентска лабораторија буде припремљена недељама унапред са радним специфичним секундарним скрининг тестовима по избору.
5

Зашто је потребно субклонирати позитивне хибридоме?

Након што су позитивни бунарићи идентификовани током почетног ELISA поступка скрининга, хибридоми су пребачени у већу запремину, тј. плоче са 24 бунарића, у припреми за поступак субклонирања. Субклонирање хибридома се обично врши методом ограниченог разблаживања како би се осигурала изолација стабилних моноклонова. Техника укључује разблаживање култура хибридома и њихово дисперговање у плоче са 96 бунарића како би се постигла моноклоналност (једна ћелија по бунарићу). Треба извршити најмање два ограничена разблаживања како би се смањио ризик од развоја мешовитих популација хибридома.
6

Које су предности коришћења хибридомске технологије за откривање антитела?

Хибридне ћелијске линије су хваљене због своје способности да производе антитела са високим афинитетом, стабилношћу и специфичношћу на најисплативији начин.