Услуга скрининга библиотеке површинског приказа квасца

Наше библиотеке за приказивање квасца имају велики капацитет и велику разноликост, што пружа високу основу за ефикасан скрининг специфичних секвенци антитела.

КОНТАКТИРАЈТЕ НАС

Услуга скрининга библиотеке површинског приказа квасца

Алфа Лајфтек је специјализована за изградњу библиотека за приказивање квасца и скрининг библиотека антитела, нудећи могућност генерисања различитих облика библиотека квасца и њиховог скрининга на антитела високог афинитета и специфична антитела за клијенте широм света. Са тимом стручних истраживача, напредном технологијом и опремом, можемо да конструишемо библиотеке квасца усмерене на широк спектар протеина повезаних са болестима. Можемо да пружимо технологије фагног приказа и приказивања квасца, укључујући приказ протеина квасца, приказ малих молекула квасца, приказ квасца антитела итд.

Наше библиотеке за приказивање квасца имају велики капацитет и високу разноликост, што пружа високу основу за ефикасан скрининг специфичних секвенци антитела. Можемо конструисати различите облике библиотека за приказивање антитела квасца (библиотеке антитела IgG, scFv, VHH, Fab), библиотеке протеина, библиотеке пептида, библиотеке цДНК итд. у складу са вашим потребама. Поред тога, можемо развити и библиотеке антитела различитих својстава, укључујући имунолошке библиотеке, природне библиотеке, синтетичке библиотеке, полусинтетичке библиотеке и библиотеке антитела за болести.

Увод у систем приказивања квасца

Технологија приказивања на површини квасца је метода приказивања рекомбинантних протеина на површини квасца путем фузије гена. Најчешћи систем приказивања квасца користи циљни протеин фузионисан са C-терминусом Aga2p подјединице алфа лектин протеина за упаривање, који се углавном састоји од епитопских ознака са обе стране циљног протеина: N-терминалне ознаке хемаглутинина (HA) од 9 аминокиселина и C-терминалне ознаке c-myc од 10 аминокиселина. Aga2p подјединица од 69 аминокиселина везује се за Aga1p подјединицу алфа лектина од 725 аминокиселина путем две дисулфидне везе, а Aga1p је усидрен за ћелијски зид путем ковалентне везе β 1,6-глукан. Стога се циљни протеин приказује на површини ћелија квасца и потом га препознаје одговарајући лиганд. Одвојите функционалне протеине из библиотека путем проточног цитометријског скрининга.

Слика 1: Принцип приказа површине квасца. (Извор слике: Примене површинског дисплеја квасца за инжењеринг протеина.)

Увод у библиотеку за приказ површине квасца

Сортирање квасца на основу приказа на површини квасца, углавном се користи за скрининг библиотека антитела усмерених на протеине ћелијске површине. Због ниског неспецифичног везивања између ћелија квасца и других ћелијских површина, биолошка селекција квасца може да скринира велике библиотеке везивања како би пронашла ретке клонове.

Услуга скрининга библиотеке површинског приказа квасца

Припремите плазмиде и култивишите ћелије квасца, синтетишите ДНК која кодира циљни протеин и клонирајте је у вектор експресије квасца који садржи индуцибилне промотере, сигналне пептиде и циљне гене спојене са протеинима површинског дисплеја (као што је Aga2p). Ген који кодира циљни протеин може се спојити са геном који кодира протеин ћелијског зида квасца (обично Aga2p), а спојени ген се може трансформисати у ћелије квасца путем електропорације. Након трансформације, ћелије квасца које експримирају гене антитела на својој површини могу се подвргнути антиген-специфичним скрининг тестовима: библиотека квасца се инкубира са циљним антигеном и селектују се ћелије квасца које се специфично везују за њега. Користећи сортирање ћелија активирано флуоресценцијом (FACS) за изолацију ћелија квасца које приказују протеине са жељеним карактеристикама, скрининг библиотеке дисплеја квасца може се извршити са максималном величином библиотеке од ~10^8-10^9 ћелија квасца. Позитивни клонови се затим могу изоловати за даљу анализу или даљу примену. Када се специфични клонови антитела идентификују из библиотеке антитела, они се могу даље карактерисати и масовно производити, и пречишћавати коришћењем техника као што је афинитетна хроматографија протеина А/Г како би се завршио цео процес скрининга дисплеја квасца и производње антитела.

Процес скрининга библиотеке квасца

Сл. 2 Процес скрининга библиотеке за приказивање квасца

Радни ток услуге скрининга библиотеке квасца

Кораци	Садржај услуге	Временска линија
Припрема антигена	Тип антигена: Ако купац може да обезбеди антигене, одговарајући узорци морају бити испоручени према типу: рекомбинантни протеини захтевају 3-3,5 мг са захтевом чистоће од преко 85%, мали молекули морају бити коњуговани са захтевом чистоће од преко 90%, синтеза пептида мора бити коњугована са захтевом чистоће од преко 90%, типови узорака као што су вируси морају бити инактивирани, РНК мора бити прегледана да би се спречила деградација, а горе наведени типови антигена такође могу бити прилагођени за синтезу.	2-3 недеље
Имунитет животиња	Број имунизација животиња је 5, и неопходно је утврдити да ли треба повећати број имунизација на основу тестирања титра серума. Антигенски имунитет: потенција протеинског/вирусног антигена > 105; потенција пептидног/маломолекуларног антигена > 10^4	5-6 недеља
Припрема шаблона цДНК	Одвојите плазма ПБМЦ, екстрахујте укупну РНК (комплет за екстракцију РНК) и реверзујте до цДНК.	1 дан
Изградња библиотеке	Користећи библиотечку цДНК као шаблон, VHH ген је амплификован помоћу два круга PCR-а, и конструисан је квасац са VHH геном за сплајсовање. Вектор је трансформисан у ћелије квасца електропорацијом да би се конструисала библиотека антитела. Насумично одабрати 48 клонова и идентификовати стопу позитивних (>90%) користећи PCR методу; Израчунати капацитет библиотеке (10^7-10^8), NGS секвенцирати да би се одредила исправна стопа уметања библиотеке (>90%) и разноликост библиотеке.	2 недеље
Пројекција у библиотеци	Стандардна три круга скрининга: FACS скрининг флуоресцентно обележених протеина, праћено NGS секвенцирањем у трећем кругу. Позитивни клонови су одабрани за индукциону експресију једног грама и ELISA детекцију. Сви позитивни клонови су одабрани за секвенцирање гена и одабране су различите секвенце CDR региона.	2-3 недеље
Верификација антитела	Конструисање одговарајућих вектора експресије за секвенце антитела може олакшати експресију антитела, пречишћавање антитела, ELISA и BLI валидацију везивања антигена антитела ради провере афинитета антитела и блокаду проточне цитометрије ради валидације функције ћелија.	1 недеља

Случај скрининга библиотеке површинског приказа квасца

У литератури о платформи за приказивање на површини квасца за брзо откривање конформационо селективних нанотела, аутори су успоставили комплетну in vitro платформу за откривање нанотела засновану на приказивању на површини квасца. Прво, дизајнирана је библиотека синтетичких нанотела почевши од гена камиле. Слика Д показује да нанотело има HA ознаку на карбоксилном крају, а затим је нанотело ковалентно фиксирано на ћелијски зид квасца. Слика Е приказује процес скрининга нанотела. Квасац са нанотелима афинитета према антигену је изолован, амплификован и више пута селектован за антитела помоћу FACS-а. Аутори су открили конформационо селективна нанотела која циљају два различита људска GPCR-а путем ове платформе.