Plattform för utveckling av bispecifika antikroppar

Alpha Lifetech kan erbjuda kunder kvalitetssäkrad antikroppsupptäckt och rekombinanta proteinprodukter och tjänster. Vi kan framställa antikroppar med hög effektivitet, stark specificitet och god stabilitet. Alpha Lifetech har en mängd olika instrument och utrustning för antikroppsrening, som kan tillhandahålla antikroppsreningstjänster från olika källor, såsom monoklonala antikroppar från kanin, får, kyckling och mus, samt affinitetsreningstjänster för protein A/G och antikroppsseparations- och reningstjänster. Baserat på den omfattande plattformskonstruktionen av antikroppsupptäcktsplattformar, proteinplattformar etc., täcker vi uppströms- och nedströmstjänster för antikroppsproduktion och kan tillhandahålla tekniska tjänster från antikroppsberedning, bispecifik antikroppsrening och antikroppsseparation och rening, antikroppssekvensering, antikroppsvalidering etc., som kan användas för bispecifik antikroppsbehandling.

Monoklonala antikroppar avser immunoglobuliner som produceras av en enda B-cell och som har hög specificitet för antigener eller epitoper. Produktion av monoklonala antikroppar framställdes initialt med hybridomteknik för att producera musantikroppar. Mer specifikt, genom att fusionera mjältceller från immuniserade möss med myelomceller från människor eller möss, bildas hybridomceller som utsöndrar specifika antikroppar. De genererade musmonoklonala antikropparna används huvudsakligen i djurforskning och sjukdomsdiagnostik efter reningstjänster. Människokroppen kommer dock att producera ett immunsvar mot främmande musproteiner, så det finns betydande begränsningar i den kliniska tillämpningen av produktion av musmonoklonala antikroppar. Senare använde man "humanisering" för att framställa monoklonala antikroppar från möss, och genteknik användes för att modifiera musantikroppar för att ha en konstant region av humant immunoglobulin för att minska deras immunogenicitet. Denna typ av antikropp är också känd som humaniserad monoklonal antikropp. Dessutom kallas användning av humana celler för att producera monoklonala antikroppar för framställning av hela humana monoklonala antikroppar. Monoklonala antikroppar används ofta inom biomedicinska och kliniska tillämpningar. Inom medicinsk forskning kan monoklonala antikroppar användas som immunmodulatorer, terapeutiska monoklonala antikroppar kan användas för cancerkemoterapi och behandling av virusinfektioner, och utveckling av monoklonala antikroppskonjugat används huvudsakligen för cancerbehandling.

Introduktion till bispecifik antikropp

År 1960 föreslogs konceptet med bispecifika antikroppar. Bispecifika antikroppar, även kända som bispecifika monoklonala antikroppar, är artificiellt syntetiserade antikroppar med hjälp av genteknik. Som en konstruerad artificiell antikropp tillhör bispecifika antikroppar vanligtvis IgG-subklassen och innehåller ett antigenbindande fragment som riktar sig mot CD3-subenheten. Bispecifika antikroppar har två specifika antigenbindningsställen som samtidigt kan binda till och känna igen två olika antigener, eller två olika epitoper av ett antigen. Jämfört med monoklonala antikroppar har bispecifika antikroppar ett ytterligare specifikt antigenbindningsställe, vilket har starkare specificitet och målinriktningsförmåga, vilket mer exakt kan rikta in sig på tumörceller och minska toxicitet utanför målet. Bispecifika antikroppar kan samtidigt utföra flera biologiska funktioner, såsom att rekrytera immunceller, blockera signalvägar och direkt döda tumörceller. Tidiga bispecifika antikroppar framställdes huvudsakligen genom kemisk konjugering eller cellfusion, men denna metod kan ha utvecklats långsamt på grund av den slumpmässiga kombinationen och svårigheten att isolera målkombinationen. Med den kontinuerliga utvecklingen av genteknik har många nya teknikplattformar utvecklats, såsom knotar i hål (KIH), CrossMab, DVD Ig, etc. Dessa plattformar löser effektivt problem som skillnader i tunga och lätta kedjor, och förbättrar enhetligheten och utbytet av bispecifika antikroppar.

Fig. 1 Förenklad schematisk översikt över de föreslagna verkningsmekanismerna för bispecifika antikroppar (bsAbs) i kliniska prövningar för onkologi.(Källa för figur: En översikt över bispecifika antikroppar och antikroppskonstruktioner inom onkologi och kliniska utmaningar - ScienceDirect)

Bispecifik antikroppsproduktionsteknik

De huvudsakliga metoderna för produktion av bispecifika antikroppar inkluderar kemisk koppling, hybridom från fyra källor och framställning av gentekniska antikroppar. Bland dessa kopplar den kemiska kopplingsmetoden två intakta IgG- eller två F(ab')2-antikroppsfragment till bispecifika antikroppar med hjälp av kemiska kopplingsmedel såsom ftalimid och ditioacylbensoesyra. Denna metod är enkel och lätt att använda, men den kan skada antigenbindningsstället, minska antikroppsaktiviteten och själva kopplingsmedlet har också en viss grad av cancerframkallande egenskaper. Hybridommetoden från fyra källor baseras på fusion av somatiska celler från två olika hybridomcellinjer för att uttrycka motsvarande mus-IgG. Genom genteknik kan antikroppar genetiskt modifieras för att bilda bispecifika antikroppar. Två olika monoklonala antikroppar konstruerades, och Fab-fragmenten eller de variabla regionerna för tung kedja och lätt kedja hos de två antikropparna klyvdes separat. Genom tvärbindningsreaktion eller kedjerekombinationsteknik kombinerades de två fragmenten för att bilda en bispecifik antikropp. Även om komplexiteten hos genteknik är relativt hög, är det för närvarande den vanligaste metoden för produktion av bispecifika antikroppar för att justera antikropparnas struktur och funktion. Vid design av bispecifik antikropp kan principen om antikroppskorsreaktivitet användas, men antikroppskorsreaktivitet kan orsaka ospecifika reaktioner, så det kommer att noggrant beaktas vid den praktiska tillämpningen av bispecifik antikroppsdesign, såsom bispecifik antikroppsbehandling.

Rening av bispecifika antikroppar

Bispecifik antikroppsrening är processen att isolera och rena högrena målantikroppar. Två metoder, centrifugering och djupfiltrering, används för att avlägsna vissa lösliga föroreningar. Den bispecifika målantikroppen fångas initialt upp med affinitetskromatografi. För IgG-liknande bispecifika antikroppar används protein A-affinitetskromatografi, medan för icke-IgG-liknande bispecifika antikroppar kan lättkedjebaserad affinitetskromatografi användas. Därefter inkuberas antikroppen under låga pH-förhållanden under en viss tidsperiod, vilket orsakar att proteinstrukturen på ytan av virushöljet störs och därigenom förlorar förmågan att infektera celler. Mellanliggande djupfiltrering utförs för att ytterligare avlägsna föroreningar såsom värdcellsproteiner (HCP). Antikropparnas renhet förbättras genom metoder som jonbyteskromatografi, och eventuella kvarvarande virus avlägsnas genom nanofiltrering eller ultrafiltreringstekniker. Slutligen koncentreras provet och ersätts med en lämplig formuleringsbuffert.

Arbetsflöde för produktionstjänster för bispecifika antikroppar

Steg	Tjänstens innehåll	Tidslinje
Gensyntes	Generering av upp till 3 olika designscheman för sekvenser, de novo-generering av rekombinanta antikropps-DNA-plasmider	2–3 veckor
Småskaligt test	Produktion av bispecifika antikroppsproteiner → Småskalig expression i däggdjurscellinjer → Validering med SDS-PAGE → Bindningsanalys med rekombinanta proteinantigener med ELISA → Jämförelse av kloner med parentala antikroppar	5–6 veckor
Identifiera	Uttryck av de två första bispecifika antikropparna i full längd → Bindningsanalys med ELISA → ELISA-utvärdering av antikroppar som igenkänns av antikroppar mot mus	1 vecka
Antikroppsproduktion	Storskalig antikroppsproduktion	3–4 veckor

Våra fördelar

Vi täcker uppströms- och nedströmstjänster inom antikroppsproduktion och kan erbjuda tekniska tjänster från antikroppsberedning, rening av bispecifika antikroppar och antikroppsseparation och rening, antikroppssekvensering, antikroppsvalidering etc., vilka kan användas för behandling av bispecifika antikroppar.

Högt uttryck

Högt proteinuttryck i CHO-celler.
Stabil förvaring

>2 veckor i serum vid 37 °C.
Inga problem med löslighet

>30 mg/ml
Stabila celllinjer

Många stabila cellinjer med tumörantigener har utvecklats för att validera många bispecifika antikroppar.