Tjänst för utveckling av monoklonala antikroppar

Alpha Lifetech Inc.kan tillhandahålla epitopprediktion, peptidsyntes, proteinuttryck, produktion av polyklonala eller monoklonala antikroppar samt antikroppsrening från cellkultur, ascitesvätska eller helserum.

Alpha Lifetech Inc.har erfarenhet av att erbjuda kunder olika stabila celllinjetjänster, inklusive hybridomceller, genomredigeringscellinjer, knockdown-cellinjer och överuttryckscellinjer. Vi strävar efter att erbjuda avancerade, skräddarsydda celllinjetjänster till varje kund och våra tjänster är beprövade och pålitliga.

Strategi för antikroppsutveckling

1. Antigendesign och beredning
Dessa antigener kan vara proteiner, peptider eller andra molekyler. Att designa immunogener kräver en omfattande metod som integrerar kunskap om antigenstruktur, immunologi och leveranssystem. Alpha Lifetech har antigendesignteknik som kan designa immunogener för kunder i behov.
Alpha Lifetech erbjuder rekombinanta proteinprodukter för kunder att välja mellan. Vi har en mängd olika proteinuttryckssystem, såsom E. coli-uttryckssystem, jästuttryckssystem, baculovirus-insektsuttryckssystem, däggdjursuttryckssystem etc., för att producera de rekombinanta proteiner du behöver för forskning.

2. Djurimmunisering
Alpha Lifetech kan förse kunder med immunogener, och immuna djur som möss, kaniner, får, alpackor, marsvin, hamstrar etc. finns tillgängliga för dig att välja mellan.

3. Metoder för produktion av monoklonala antikroppar

●Mabs-produktion med hybridomteknik
Hybridom är en hybridcell som produceras genom fusion av två typer av celler, nämligen musmyelomcellinjer och plasmaceller (lymfocyt B), där den heterozygota cellen kan producera kontinuerliga antikroppar mot antigenet av intresse in vitro. Produktionen av en hybridomcellinje består av tre delar: antigendesign (haptener, små molekyler och peptider), djurimmunisering, cellfusion och positiv klonscreening. Genom att använda unika immuniseringsmetoder uppnår vi exceptionellt hög cellfusionseffektivitet (1–10 hybridom per tusen B-celler) och höga antikroppstitrar, vilket maximerar vår framgångsgrad i efterföljande analytiska tester som inkluderar biokemisk screening, cellbaserade analyser in vitro och djurstudier.

●Mabs-produktion med fagdisplayteknik
Fagdisplay erbjuder en annan metod för att generera monoklonala antikroppar. B-lymfocyter isoleras från djurblod och deras mRNA extraheras. Genom PCR omvandlas detta mRNA till cDNA, vilket amplifierar alla VH- och VL-segment. Dessa segment klonas sedan in i en vektor, vanligtvis som enkelkedjiga variabla fragment (scFv), tillsammans med PIII-proteinet från en bakteriofag. Därefter används denna konstruktion för att infektera E. coli, vilket resulterar i skapandet av ett bibliotek som innehåller cirka 10^10 celler genom inokulering med en hjälparfag. E. coli kan sedan utsöndra bakteriofagen som innehåller VH- och VL-segmenten som en del av sitt hölje. Därefter kan specifika VH- och VL-segment som riktar sig mot antigenet av intresse väljas ut och användas för att återinokulera E. coli med bakteriofagen. Celler som innehåller plasmiden isoleras sedan och sekvenseras.

4. Fusionsscreening

●Cellfusion och selektion
De skördade B-cellerna fuseras sedan med myelomceller, vilka är cancerceller som kan föröka sig obegränsat i kultur. Fusionen uppnås vanligtvis med hjälp av en teknik som polyetylenglykol (PEG)-fusion.
Efter fusion odlas hybridomcellerna i ett selektivt medium som endast tillåter hybridomen att överleva. Mediet innehåller vanligtvis aminopterin, vilket förhindrar tillväxten av icke-fusionerade myelomceller.

●Screening och clonging
De resulterande hybridomcellerna screenas för produktion av antikroppar specifika mot målantigenet. Detta görs vanligtvis med hjälp av tekniker som enzymlänkad immunosorbentanalys (ELISA), Western blot, immunoprecipitation och flödescytometri.

När hybridomceller som producerar antikroppen har identifierats klonas de för att generera en population av identiska celler. Detta säkerställer att antikroppen som produceras av varje hybridomcell är identisk.

5. Verifiering av antikroppsfunktion
Alpha Lifetech tillhandahåller funktionell validering av antikroppar, såsom Western blotting, immunohistokemi eller funktionella analyser, för att karakterisera monoklonala antikroppar och bekräfta antikroppsspecificitet, affinitet och funktionalitet.

6. Antikroppsoptimering
Rening av antikroppar från kultursupernatant med hjälp av tekniker som protein A- eller protein G-affinitetskromatografi, och Alpha Lifetech kan också tillhandahålla antikroppsmodifieringsmetoder för att förbättra antikroppsaffiniteten.

7. Antikroppsproduktion
Alpha Lifetech kan utvärdera kandidatantikroppar för högkapacitetsscreening och storskalig produktion.

vanliga frågorvanliga frågor

Vanliga frågor om utveckling av monoklonala antikroppar

1

Hur väljer man rätt fusionshybridom?

Under fusionsprocessen sås 10–15 mikrotiterplattor med 96 brunnar med fusionshybridblandningen. Varje platta matas med HAT-IMDM-selektionsmedium och hålls i en koldioxidinkubator vid 37 grader Celsius. 9–14 dagar efter fusionen testas hybridsupernatanten för närvaro av den specifika antikroppen av intresse.
2

Hur kan man förbättra urvalseffektiviteten?

Fusion av plasmaceller med deras myelommotsvarigheter är inte 100 % effektiv. Även under optimala förhållanden och den mest effektiva stimuleringen producerar cellfusion fortfarande en blandning av icke-konfluenta och konfluenta celler som behöver separeras. För att förbättra effektiviteten i selektionsprocessen saknar myelomceller som används för fusion HGPRT, ett viktigt enzym i nukleotidräddningsvägen. Blandningen odlades sedan i ett HAT-medium, där endast celler med HGPRT-enzymet, hybridom som ärvt HGPRT från plasmaceller, var livskraftiga.
3

Hur screenar man hybridomcellinjer för antikroppsaktivitet?

Utvärderingen av hybridvarianter är ett avgörande steg. Vanligtvis sker screening av hybridom-, klon- och subklonsupernatant genom enzymlänkad immunosorbentanalys (ELISA), Western blot-analys och fluorescensaktiverad cellsortering (FACS). Vi väljer att utföra all screening av supernatanten i vårt eget laboratorium.
4

Ge detaljerade instruktioner om hur man utför screening för antikroppsaktivitet?

Hybridomsupernatanter som ska testas kan variera från 500 till 1 440 prover och kommer att vara redo att testas inom dag 9–14. Vi kan komma fram inom en period på tre till fem dagar eller så kan alla vara redo samma dag, så det är viktigt att klientlaboratoriet är förberett veckor i förväg med att arbeta med specifika sekundära screeninganalyser efter eget val.
5

Varför behöver positiva hybridom subklonas?

Efter att positiva brunnar identifierats under den initiala ELISA-screeningsproceduren överfördes hybridom till en större volym, dvs. 24-brunnsplattor, som förberedelse för subkloningsproceduren. Subkloning av hybridom utförs vanligtvis med en begränsad utspädningsmetod för att säkerställa isolering av stabila monokloner. Tekniken innebär att hybridomkulturer späds ut och dispergeras i 96-brunnsplattor för att uppnå monoklonalitet (en cell per brunn). Minst två begränsade utspädningar bör utföras för att minska risken för att utveckla blandade hybridompopulationer.
6

Vilka är fördelarna med att använda hybridomteknik för att upptäcka antikroppar?

Hybridcellinjer har hyllats för sin förmåga att producera antikroppar med hög affinitet, stabilitet och specificitet på det mest kostnadseffektiva sättet.