தொடர்பு அளவீட்டு தளம்
ஆக்டெட் மற்றும் பயாகோர்-T2000 தளத்தை அடிப்படையாகக் கொண்ட ஆல்பா லைஃப்டெக் நம்பகமான தொடர்பு தீர்மான சேவைகளை வழங்க முடியும். ஆன்டிபாடிகள், செல்கள், புரதங்கள், சிறிய மூலக்கூறுகள் போன்ற பல மாதிரிகளுக்கு தொடர்பு தீர்மானத்தை நாங்கள் வழங்க முடியும். மேற்பரப்பு பிளாஸ்மோன் ஒத்ததிர்வு (SPR) மற்றும் உயிரி-அடுக்கு குறுக்கீடு (BLI) தொடர்பு தீர்மானம் உள்ளிட்ட பல்வேறு தொடர்பு தீர்மான முறைகள் உள்ளன.
Alpha Lifetech ஒரு தொழில்முறை மற்றும் துல்லியமான தொடர்பு நிர்ணய தளத்தைக் கொண்டுள்ளது, இது ELISA ஐ இணைப்பு நிர்ணயத்துடன் இணைத்து, உலகளாவிய வாடிக்கையாளர்களுக்கு தொழில்முறை, திறமையான, விரைவான மற்றும் துல்லியமான தொடர்பு நிர்ணய முடிவுகளை வழங்குகிறது. வாடிக்கையாளர்கள் தேர்வுசெய்ய இரண்டு முறைகளை நாங்கள் வழங்க முடியும்: விரைவான இணைப்பு நிர்ணயம் மற்றும் துல்லியமான இணைப்பு நிர்ணயம். விரைவான இணைப்பு நிர்ணயம் என்பது ஒற்றை-செறிவு நிர்ணயம் ஆகும், அதே நேரத்தில் துல்லியமான இணைப்பு நிர்ணயம் வெவ்வேறு செறிவுகளின் தொடர்புகளை அளவிட முடியும். பல்வேறு சிறிய மூலக்கூறு சேர்மங்கள், பெப்டைடுகள், புரதங்கள், ஒலிகோநியூக்ளியோடைடுகள் மற்றும் ஒலிகோமர்கள், அத்துடன் லிப்பிடுகள், பாக்டீரியோபேஜ்கள், வைரஸ்கள் மற்றும் செல்கள் ஆகியவற்றுக்கு இடையேயான தொடர்புகளின் ஆய்வுக்கு இது பொருந்தும். இணைப்பு அளவீட்டு தளம் இணைப்பு மருந்து சோதனை மற்றும் திரையிடல், ஆன்டிபாடி கண்டுபிடிப்பு மற்றும் அடுத்தடுத்த ஆராய்ச்சிக்கு அடித்தளத்தை அமைக்கும்.
பிணைப்பு உறவின் அறிமுகம்
மூலக்கூறு இடைவினைகள், இணைப்பு மருந்து மதிப்பீடுகள் மற்றும் மருந்து பரிசோதனை ஆகியவற்றை மதிப்பிடுவதில் தொடர்பு முக்கியமானது. மூலக்கூறு இடைவினைகளை L + R = LR சமன்பாடுகளால் விவரிக்கலாம், இங்கு L என்பது கட்டற்ற லிகண்டுகளைக் குறிக்கிறது, R என்பது கட்டற்ற ஏற்பிகளைக் குறிக்கிறது, மற்றும் L என்பது பிணைக்கப்பட்ட லிகண்ட்-ஏற்பி வளாகங்களைக் குறிக்கிறது. பிணைப்பு எதிர்வினைகள் மூலக்கூறு இடைவினைகளை வரையறுக்கின்றன, அங்கு சமநிலை அடையும் வரை எதிர்வினையின் போது பிணைக்கப்பட்ட மற்றும் கட்டற்ற நிலைகளுக்கு இடையில் மாறும் பரிமாற்றம் நிகழ்கிறது. இதை எதிர்வினையின் இரண்டு விகித மாறிலிகளான Kon (பிணைப்பு விகித மாறிலி) மற்றும் Koff (விலகல் விகித மாறிலி) மூலம் விவரிக்கலாம். பிணைப்பு மாறிலியின் (Ka) பரஸ்பரமான Kd மதிப்பு, எதிர்வினை உறவிற்கான ஒரு முக்கியமான மாறிலி Koff/Kon ஆகும். எனவே, இரண்டு மூலக்கூறுகளுக்கு இடையிலான பிணைப்பு இறுக்கமாக இருந்தால், தொடர்பு அதிகமாகும். Kd மதிப்பு சிறியதாக இருந்தால், நேர்மாறாகவும் இருக்கும். இந்த சமன்பாட்டை ஒரு அரை-மடக்கை வரைபடத்தில் S-வடிவ வளைவாகக் குறிப்பிடலாம், x-அச்சில் (மடக்கை அளவுகோல் அச்சில்) லிகண்ட் செறிவு மற்றும் y-அச்சில் பின்ன எல்லையுடன். கோடிட்ட கோடு 0.5 பிணைப்பு பின்னத்தின் Kd (1 nM) இல் உள்ள லிகண்ட் செறிவைக் குறிக்கிறது.

படம் 1: செல் மேற்பரப்பு ஏற்பியுடன் பிணைக்கப்பட்ட லிகண்டின் மாறுபட்ட செறிவுகளின் சிக்மாய்டல் பிணைப்பு வளைவு. (குறிப்பு மூலம்: ஹண்டர் எஸ்.ஏ., கோக்ரான் ஜே.ஆர். புரதம்-புரத தொடர்புகளின் தொடர்பைத் தீர்மானிப்பதற்கான செல்-பிணைப்பு ஆய்வுகள்: தொழில்நுட்பங்கள் மற்றும் பரிசீலனைகள்.)
உறவை தீர்மானிப்பதற்கான முறைகள்
ELISA பிணைப்பு தொடர்பு மதிப்பீடு
ஆன்டிபாடி உறவைப் படிப்பதற்கான பரவலாகப் பயன்படுத்தப்படும் நுட்பம் ELISA முறையை அடிப்படையாகக் கொண்டது, இது அதன் வசதி, வேகம், எளிமை, அதிக உணர்திறன் மற்றும் வலுவான தனித்தன்மை ஆகியவற்றால் வகைப்படுத்தப்படுகிறது. இது ஒரு சிறிய அளவிலான வினைப்பொருட்களை (அதாவது, ஆன்டிபாடிகள் மற்றும் ஆன்டிஜென்கள்) பயன்படுத்தலாம் மற்றும் சுத்திகரிப்பு வினைப்பொருட்களின் தேவை இல்லாமல் ஆன்டிபாடி உறவை அளவிட முடியும். ஒரு திடமான மேற்பரப்பில் ஆன்டிஜெனை அசையாமல், ஒரு முதன்மை ஆன்டிபாடியைப் பயன்படுத்தி அதைக் கண்டறிவதன் மூலம், பெயரிடப்பட்ட இரண்டாம் நிலை ஆன்டிபாடி முதன்மை ஆன்டிபாடியுடன் வினைபுரிந்து ஒரு நொதி-இணைக்கப்பட்ட இம்யூனோசார்பன்ட் அஸே (ELISA) ரீடரில் தரவைப் படித்து பகுப்பாய்வு செய்கிறது.

படம் 2: வடிவமைக்கப்பட்ட பெப்டைட்களை அவற்றின் இலக்குகளுடன் பிணைப்பதை மதிப்பிடுவதற்கான ELISA போன்ற மதிப்பீடுகள். (குறிப்பு மூலம்: ஹாஜிகரிம்லோ, மரியம், மற்றும் பலர்., 2022. SARS-CoV-2 மேற்பரப்பு புரதம் S ஐக் கண்டறியும் பெப்டைட்களை விரைவாக வடிவமைப்பதற்கான ஒரு கணக்கீட்டு அணுகுமுறை.)
மேற்பரப்பு பிளாஸ்மோன் ஒத்ததிர்வு (SPR) பிணைப்பு தொடர்பு மதிப்பீடு
SPR தொழில்நுட்பம் முக்கியமாக ஒளிவிலகல் குறியீட்டில் ஏற்படும் மாற்றங்களைக் கண்டறிகிறது. பாரம்பரிய ஒளியியல் நிகழ்வுகள் மற்றும் ஒளியின் அதிர்வு நிகழ்வின் உதவியுடன், உயிரி மூலக்கூறுகளுக்கு இடையிலான தொடர்புக்கான ஒரு உயிரி உணர்திறன் பகுப்பாய்வு தொழில்நுட்பத்தை உயிரி உணர்திறன் சில்லுகளில் உள்ள லிகண்ட்கள் மற்றும் பகுப்பாய்வுகளுக்கு இடையிலான தொடர்புகளைக் கண்டறிய உருவாக்க முடியும். உயிரியல் எதிர்வினைகளின் போது SPR கோணங்களில் ஏற்படும் மாறும் மாற்றங்களைக் கண்காணிப்பதன் மூலம் உயிரி மூலக்கூறுகளுக்கு இடையிலான பிணைப்பு மற்றும் தொடர்புக்கான குறிப்பிட்ட சமிக்ஞைகளைப் பெறலாம்.

படம் 3: H10/AGR2 பிணைப்பின் மேற்பரப்பு பிளாஸ்மோன் ஒத்ததிர்வு (SPR) பகுப்பாய்வு. (குறிப்பு மூலம்: கேரி, கரோலினா, மற்றும் பலர்., 2018. முன்புற சாய்வு ஹோமோலாக் 2 (AGR2) க்கு எதிராக ஒரு புதிய பெப்டைடை அடையாளம் காணுதல், வகைப்படுத்துதல் மற்றும் பயன்படுத்துதல்.)
உயிரி அடுக்கு குறுக்கீடு (BLI) பிணைப்பு தொடர்பு மதிப்பீடு
பயோஃபிலிம் குறுக்கீடு தொழில்நுட்பம் என்பது ஒரு லேபிள் இல்லாத, நிகழ்நேர கண்காணிப்பு ஒளியியல் கண்டறிதல் நுட்பமாகும், இது முக்கியமாக மூலக்கூறு இடைவினைகள் மற்றும் புரத செறிவு தீர்மானத்தின் விரிவான அளவு பகுப்பாய்விற்குப் பயன்படுத்தப்படுகிறது. இந்த தொழில்நுட்பம் மாதிரியில் உள்ள பயோஃபிலிமின் தடிமன் மாற்றங்களை நேரடியாகக் கண்டறிய ஆய்வு அடிப்படையிலான பயோசென்சாரைப் பயன்படுத்துகிறது. குறுக்கீடு நிறமாலையின் இடப்பெயர்ச்சி மாற்றங்களைக் கண்டறிவதன் மூலம், சென்சார் மேற்பரப்பில் தொடர்பு கொள்ளும் உயிரி மூலக்கூறுகளுக்கு இடையிலான பிணைப்பு மற்றும் விலகல் கண்டறியப்படுகிறது, மேலும் குறுக்கீடு நிறமாலையின் நிகழ்நேர இடப்பெயர்ச்சி (nm) காட்டப்படும்.

படம் 4: aLDRG மற்றும் கைட்டினோலிகோசாக்கரைடுகளுக்கு இடையிலான உயிரியல் அடுக்கு இடைச்செருகல் அளவீடு (BLI) மதிப்பீடு. (குறிப்பு மூலம்: லி, பிங், 2023. ஆர்மிலேரியா இனத்தின் ரைசோமார்ப்ஸ் மற்றும் ஹைஃபே இடையேயான ஒப்பீட்டு டிரான்ஸ்கிரிப்டோமின் அடையாளங்கள். 541 LysM களங்களுக்கு முக்கியத்துவம் கொடுத்து பூஞ்சை கூட்டுவாழ்வில் பங்கேற்பது.)
BLI மற்றும் SPR தொழில்நுட்பத்தின் ஒப்பீடு
| தொழில்நுட்பத்தின் பெயர் | BLI (உயிர்-அடுக்கு இடைச்செருகல் அளவியல்) | SPR (மேற்பரப்பு பிளாஸ்மோன் ஒத்ததிர்வு) |
|---|---|---|
| கொள்கை | சென்சார் மேற்பரப்பில் பிரதிபலித்த ஒளியின் குறுக்கீடு வடிவத்தில் ஏற்படும் மாற்றங்களை அளவிடுகிறது, உயிரி அடுக்கில் ஒளியியல் தடிமன் மாற்றங்கள் மூலம் மூலக்கூறு தொடர்புகளைக் கண்டறிகிறது. இது நிகழ்நேர பிணைப்பு வளைவை (நேரடி அளவீடு) வழங்குகிறது. | சென்சார் சிப்பின் மேற்பரப்புக்கு அருகிலுள்ள ஒளிவிலகல் குறியீட்டில் சமிக்ஞை மாற்றங்களைக் கண்டறிவதன் மூலம் மூலக்கூறு தொடர்புகளை அளவிடுகிறது (ஒளி தங்கம் மற்றும் கண்ணாடி இடைமுகத்துடன் தொடர்பு கொள்ளும்போது நிகழ்கிறது, இதனால் ஒளிவிலகல் குறியீட்டில் மாற்றங்கள் ஏற்படுகின்றன). தரவு அதிர்வு கோணத்தில் ஏற்படும் மாற்றங்களாக பிரதிபலிக்கிறது (மறைமுக அளவீடு). |
| உற்பத்தியாளர் | சார்டோரியஸ் | ஜிஇ |
| கருவி | ஃபோர்டேபயோ பயோசென்சர்கள் | திறந்த SPR கருவி |
| அமைப்பு | ஃபோர்டேபயோ ஆக்டெட் சிஸ்டம் (மூலக்கூறு தொடர்பு பகுப்பாய்விற்கு) | டிரேஸ் டிராவர் (ரிட்ஜ்வியூ இன்ஸ்ட்ருமென்ட்ஸ், ஸ்வீடனால் உருவாக்கப்பட்டது) |
| நன்மைகள் | 1. பரந்த மாதிரி இணக்கத்தன்மை, சிறந்த நிலைத்தன்மை, குறிப்பாக சிறிய மூலக்கூறுகளைக் கண்டறிவதற்கு (மாதிரி தூய்மை மற்றும் இடையக நிலைமைகளுக்கான குறிப்பிட்ட தேவைகள் குறைவான கடுமையானவை). பிணைப்பு ஆய்வுகளுக்கு SSA சில்லுகள் செலவு குறைந்தவை. 2. SPR உடன் ஒப்பிடும்போது வேகமான செயல்திறன் மற்றும் குறுகிய சோதனை நேரங்கள். | 1. நீண்ட வளர்ச்சி வரலாறு, BLI உடன் ஒப்பிடும்போது அதிக உணர்திறனை வழங்குகிறது. 2. அதிக ஈடுபாடு மற்றும் குறிப்பிட்ட தரவுகளுடன் அரிய அல்லது மதிப்புமிக்க புரதங்களைக் கண்டறிதல் போன்ற குறிப்பிட்ட பயன்பாடுகளுக்கு அதிக துல்லியம் மற்றும் வலிமை. |
| குறைபாடுகள் | 1. SPR உடன் ஒப்பிடும்போது தரவு துல்லியம் சற்று குறைவு. 2. கருவியை கவனமாகப் பராமரிக்க வேண்டும். 3. SSA சிப்பின் விலை ஒப்பீட்டளவில் அதிகம். | 1. மிகச் சிறிய மூலக்கூறுகளைக் கண்டறிவதற்கான இடையக நிலைமைகள் கோரக்கூடியதாக இருக்கலாம், இது கண்டறிதல் தோல்வியின் அபாயத்தை அதிகரிக்கும். 2. BLI-யில் பயன்படுத்தப்படுவதை விட சில்லுகள் பொதுவாக விலை அதிகம். 3. நீட்டிக்கப்பட்ட பரிசோதனைகளின் போது மாதிரி ஆவியாதல் ஒரு சிக்கலாக இருக்கலாம். |
| சிப் வகை | SSA சிப் | NTA சிப் |
தொடர்பு அளவீட்டின் நோக்கம்
இணைப்புத் தீர்மானத்தில் ஆன்டிஜென்-ஆன்டிபாடி (வலுவான ஆன்டிஜென்-ஆன்டிபாடி, பலவீனமான ஆன்டிஜென்-ஆன்டிபாடி), புரதம்-புரதம், புரதம்-பெப்டைட், புரதம்-சிறிய மூலக்கூறு மற்றும் புரதம் டிஎன்ஏ/ஆர்என்ஏ (அப்டேமர்) ஆகியவை அடங்கும். கேடியை அளவிடும்போது, மோலார் செறிவுகளில் ஒன்றை அறிந்து கொள்வது அவசியம். சிறிய மூலக்கூறுகள் பிணைக்கப்படும்போது, ஒரு மூலக்கூறு எடை 150 டால்டன்களுக்குக் குறைவாக இருக்கக்கூடாது.
| வகை | நோக்கம் | தற்காப்பு நடவடிக்கைகள் |
|---|---|---|
| 1. ஆன்டிஜென்-ஆன்டிபாடி | 10^-6 முதல் 10^-12 வரை | பெரும்பாலான ஆன்டிபாடிகளின் Kd மதிப்புகள் 10^-6-10^-7 முதல் 10^-9 வரை இருக்கும். பொதுவாக உயர்-தொடர்பு ஆன்டிபாடிகள் 10^-9 க்குள் இருக்கும் என்றும், அதே நேரத்தில் உயர்-தொடர்பு ஆன்டிபாடிகள் 10^-12 க்குள் இருக்கும் என்றும் நம்பப்படுகிறது. ஆன்டிபாடிகள் 10^-12 க்குள் இருக்கும். |
| 2. புரதம் - சிறிய மூலக்கூறுகள் | 10^-4 முதல் 10^-5 வரை | சிறிய மூலக்கூறுகள் மற்றும் புரதங்களின் KD 10^-4 முதல் 10^-5 வரை இருக்கும், அதே சமயம் 10^-3 மற்றும் 10^-7 ஆகியவை இயல்பானவை மற்றும் 10^-10 ஐ அடைய முடியாது. சிறிய கோவலன்ட் மூலக்கூறுகள் 10^-10 ஐ அடையலாம். |
| 3. அவிடின்-பயோட்டின் | 10^-14 | அஃபினிட்டி எளிதில் குறிப்பிட்ட அல்லாத பிணைப்புக்கு உட்படும், மேலும் ஸ்ட்ரெப்டாவிடின் அல்லது டிகிளைகோசைலேட்டட் அஃபினிட்டியைப் பயன்படுத்தலாம். |
| 4. டிஎன்ஏ-புரதம் | 10^-8 முதல் 10^-10 வரை | உயர்தர மற்றும் முழுமையான டிஎன்ஏ; எலக்ட்ரோபோரேசிஸின் செல்வாக்கைத் தடுக்க கவனமாக இருங்கள். |
தொடர்பு தீர்மானத்திற்கான மாதிரி தேவைகள்
| மாதிரி | தேவைகள் |
|---|---|
| 1. பெரிய மூலக்கூறு மாதிரி | புரதம் > 50 µg, ஆன்டிபாடி > 100 µg, பயோடைனைலேட்டட் புரதம் > 200 µg; பயோட்டின் இல்லாத புரதம் > 2 மி.கி., தூய்மை தேவை > 90%, இடையக கரைசல்: PBS, HEPBS. இமிடாசோல் குழுக்களைக் கொண்டிருக்க முடியாது; தரக் கட்டுப்பாடு தேவை. |
| 2. சிறிய மூலக்கூறு மாதிரி | அளவு>1 மி.கி., தூள் அல்லது திரவம், திரவம் தண்ணீரில் அல்லது DMSO இல் கரையக்கூடியதாக இருக்க வேண்டும். கிளிசரால், இமிடசோல், ட்ரெஹலோஸ் அல்லது பிற உப்புகளைக் கொண்டிருக்க வேண்டாம்; டிரிஸ் போன்ற அமினோ குழுக்களைக் கொண்ட வினையாக்கிகளைத் தவிர்க்க முயற்சிக்கவும், பொதுவாக PBS, HEPPS போன்றவை கரிம வினையாக்கிகள் இல்லாமல். |


பல மாதிரி பகுப்பாய்வு
ஆன்டிபாடிகள், செல்கள், புரதங்கள் மற்றும் பிற உயிர் மூலக்கூறுகள் உள்ளிட்ட பல்வேறு மாதிரிகளுக்கு ஆல்பா லைஃப்டெக் தொடர்பு மதிப்பீடுகளை வழங்க முடியும்.


முதிர்ந்த தொழில்நுட்ப தளம்
எங்களிடம் spr பைண்டிங் அஸே, bli பைண்டிங் அஸே மற்றும் elisa பைண்டிங் அஸே போன்ற மேம்பட்ட தொழில்நுட்பங்கள் உள்ளன.


நெகிழ்வான திட்டத் தேர்வு
வாடிக்கையாளர்கள் விரைவான தொடர்புத் தீர்மானம் மற்றும் துல்லியமான தொடர்புத் தீர்மானம் ஆகியவற்றிற்கு இடையே தேர்வு செய்யலாம்.


உயர் துல்லிய முடிவுகள்
எங்கள் தொழில்முறை தொழில்நுட்பக் குழு திறமையான, துல்லியமான மற்றும் நம்பகமான தொடர்பு தீர்மான முடிவுகளை உறுதிசெய்ய முடியும்.
வழக்கு ஆய்வுவழக்கு
BLI விரைவு தொடர்பு மதிப்பீடு ஆன்டிபாடி மற்றும் அப்டாமர் தொடர்பு மதிப்பீடு
SA ஆய்வு விவரக்குறிப்புடன் கூடிய பயோடினைலேட்டட் அப்டேமர்களைப் பிடித்து அவற்றைக் கரைக்கவும். மாதிரியை ஒரு நிலையான செறிவுக்குக் கரைத்து நீர்த்துப்போகச் செய்யவும், ஆய்வு-குறிப்பிட்ட கைப்பற்றப்பட்ட இலக்கு 1-5 அப்டேமர்களை திடப்படுத்தவும், சமிக்ஞை செறிவூட்டலுக்குப் பிறகு, மாதிரியுடன் பிணைக்கவும். பின்னர் அவற்றை 96-கிணறு தட்டில் சேர்க்கவும்.


படம் 5: 96-கிணறு தகடு மாதிரிகளுக்கான கண்டறிதல் நிலைகளின் பரவல். B என்பது சென்சார்களை சமநிலைப்படுத்துவதற்கும் பிரிப்பதற்கும் பயன்படுத்தப்படும் இடையகத்தைக் குறிக்கிறது. L: பயோட்டின் இலக்கு 1-5 அப்டேமர்கள், 221: மாதிரி.
தரவின் நிலைத்தன்மை மற்றும் துல்லியத்தை உறுதிசெய்ய துளையிடுதலில் கவனம் செலுத்துங்கள், மேலும் முடிவுகளைப் பெற தொடர்புடைய நிரலை அமைக்கவும்:

படம் 6: இலக்கு 1, 2, மற்றும் 3 அப்டேமர்கள் மற்றும் மாதிரிகளுக்கு இடையிலான தொடர்பு பொருத்தும் வரைபடம். (CH 1 \ 3 \ 5 என்பது திடப்படுத்தப்பட்ட இலக்கு 1 \ 2 \ 3 அப்டேமர்கள் ஆய்வுக்கும் மாதிரிக்கும் இடையிலான தொடர்புகளின் சமிக்ஞை மற்றும் தரவைக் குறிக்கிறது.)

படம் 7: இலக்கு 4 மற்றும் 5 அப்டேமர்கள் மற்றும் மாதிரிகளுக்கு இடையிலான தொடர்பு பொருத்தும் வரைபடம். (CH 1 \ 3 என்பது திடப்படுத்தப்பட்ட இலக்கு 4 \ 5 அப்டேமர் ஆய்வுக்கும் மாதிரிக்கும் இடையிலான தொடர்புகளின் சமிக்ஞை மற்றும் தரவைக் குறிக்கிறது.)
முடிவுகள் காட்டுகின்றன
பின்வரும் முடிவுகள் பெறப்பட்டன: பொருத்தப்பட்ட பிறகு மாதிரியுடன் Target 1 அடாப்டரின் தொடர்பு 9.41 ^ -8; பொருத்தப்பட்ட பிறகு மாதிரியுடன் Target 2 அடாப்டரின் தொடர்பு 8.32 ^ -8; பொருத்தப்பட்ட பிறகு மாதிரியுடன் Target 3 அடாப்டரின் தொடர்பு 8.64 ^ -8; பொருத்தப்பட்ட பிறகு மாதிரியுடன் Target 4 அடாப்டரின் தொடர்பு 3.70 ^ -8; பொருத்தப்பட்ட பிறகு மாதிரியுடன் Target 5 அடாப்டரின் தொடர்பு 3.01 ^ -8.
உங்களிடம் ஏதேனும் கேள்விகள் இருந்தால், எந்த நேரத்திலும் எங்களைத் தொடர்பு கொள்ளலாம்.
Leave Your Message
01 தமிழ்02 - ஞாயிறு



2018-07-16 

