Служба дозрівання афінності антитіл

Компанія «Альфа Лайфтех»Можемо запропонувати послугу з дозрівання афінності антитіл за допомогою технологій мутації та селекції. Зазвичай ми використовуємо scFv як формат антитіл у процесах дозрівання афінності та систему моновалентного дисплейного фагеміду, яка використовується для зменшення ефектів авідності під час скринінгу зв'язування антигену. Наша команда професіоналів також може надати послуги з дозрівання афінності для однодоменних антитіл.

Компанія «Альфа Лайфтех»пишається тим, що пропонує комплексні послуги для задоволення різноманітних потреб клієнтів з усього світу. Наша мета — зрозуміти та задовольнити потреби різних клієнтів, а також допомогти з будь-якими майбутніми та виникаючими проблемами в дослідницькій роботі.

Що таке дозрівання спорідненості?

Афінне дозрівання – це процес, за допомогою якого антитіла зазнають повторних мутацій та відбору для посилення їхньої афінності до специфічних антигенів. В-клітини, що переважно знаходяться в зародковому центрі вторинних лімфоїдних органів, зазнають соматичної гіпермутації та відбору під впливом Т-клітин та фолікулярних дендритних клітин.
Під час процесу дозрівання афінності, B-клітини з низькоафінними поверхневими рецепторами імуноглобулінів активуються зустріччю з антигеном і зазнають проліферації та диференціації. Шляхом дозрівання афінності соматичної гіпермутації відбуваються випадкові заміни нуклеотидів у варіабельній області генів імуноглобулінів, що призводить до продукування різних варіантів антитіл. Після соматичної гіпермутації, антиген-керований відбір здійснюється на B-клітинах з мутованими рецепторами імуноглобулінів. B-клітини, які продукують антитіла з підвищеною антигенною афінністю, переважно зберігаються та отримують можливість проліферувати, тоді як B-клітини зі зниженою або незмінною афінністю зазнають апоптозу. Цей ітеративний процес мутації та відбору призводить до продукування клонів B-клітин, що призводить до продукування антитіл з поступово вищою афінністю до антигену.

Служба дозрівання афінності антитіл

Головними перевагами методів на основі ПЛР є те, що мутації точно спрямовані на ампліфікований фрагмент; рівень помилок легко контролювати, а метод швидко та легко налаштувати, і він не використовує небезпечних хімічних речовин. Загальновідомо, що ДНК-полімераза Taq дублює ДНК з низькою точністю, головним чином через відсутність коректувальної активності від 3' до 5'.Альфа ЛайфтехПлатформа інженерії антитіл застосовує схильний до помилок підхід ПЛР для мутації переважно CDR-ділянк під час конструювання підбібліотеки. І часто ми створюємо мутації в абсолютно випадкових позиціях по всіх фрагментах VH та VL, щоб збільшити генетичне різноманіття підбібліотеки. Після конструювання бібліотеки генів мутованих антитіл за допомогою схильної до помилок ПЛР, відбір високоафінних варіантів (афінність антитіл scFv може досягати 10^8 - 10^10 M) виконується або шляхом пэннінгу в розчині, або на іммобілізованому антигені з умовами промивання, оптимізованими для селекції, залежної від швидкості відключення.

Вчені вКомпанія «Альфа Лайфтех»Використовуйте штами-мутатори Escherichia coli mutAD5TM як одну з кількох стратегій мутації для введення випадкових мутацій і тим самим модифікації афінності та експресії фрагментів рекомбінантних антитіл. Умови відбору можна модифікувати для фрагментів антитіл зі збільшеним рівнем продукції. Умови росту в клітинах-мутаторах Escherichia coli можна скоригувати для введення однієї випадкової точкової мутації на кілобазу ДНК, що майже еквівалентно одній зміні кодона на фрагмент scFv. Після кількох циклів мутації, дисплея та відбору ми можемо покращити константу афінності з 10^5 - 10^6 M до 10^8 - 10^10 M.

Покращення стратегій дозрівання спорідненості

Певні позиції антитіл можуть бути рандомізовані з визначеною різноманітністю (наприклад, повна рандомізація з усіма 20 амінокислотами або зміщена рандомізація з вибраними амінокислотами у фіксованих відсотках) для покращення афінності. Ми маємо дві стратегії для покращення афінності антитіл: по-перше, мутації вводяться в обмежені позиції в областях, що визначають комплементарність (CDR), шляхом сайт-спрямованого мутагенезу; по-друге, мутації вводяться у всі V-кодувальні області шляхом випадкового мутагенезу. Використовуючи ці два методи, консервативні амінокислотні послідовності або вся каркасна область антитіла будуть заміщені іншими амінокислотами, що в поєднанні з нашими технологіями сканування пептидних бібліотек може надзвичайно підвищити афінність антитіл, що цікавлять, до дуже високого рівня.

Спорідненість фагового дисплея до антитіл

Після створення бібліотеки мутантів scFv доступні дві стратегії скринінгу: біопанінг та сортування за твердим антигеном. У першій стратегії для виділення високоафінних антитіл використовується субтрактивна концентрація субстрату, оскільки низькоафінні мутанти вимиваються, залишаючи високоафінні фагові частинки. Друга стратегія використовує мічений антиген у розчині, відбір на основі константи рівноваги (Kd) та відбір на основі кінетики зв'язування. Цей підхід до відбору виділяє варіанти антитіл з покращеною Kd.