Технологія фагового дисплею полягає у вставці чужорідного цільового гена у специфічне положення капсидного білка фага та експресії чужорідного гена на поверхні фага без впливу на нормальну функцію фага. Після кількох раундів скринінгу нарешті було отримано цільовий білок із високою специфічністю та біологічною активністю.

За допомогою цієї технології можна створювати високопродуктивні бібліотеки антитіл. Цикл скринінгу короткий, операційний процес простий, а спектр застосування широкий, що дозволяє ідентифікувати оптимальні послідовності для цільових пептидів або білків. У застосуваннях, пов'язаних з вірусами, дослідники можуть виявляти антитіла, які зв'язуються з критичними вірусними епітопами, шляхом скринінгу великих бібліотек антитіл. Цей процес може перешкоджати проникненню, реплікації або механізмам імунного уникнення вірусів, тим самим закладаючи основу для лікування захворювань.

Технологія фагового дисплею використовується ширше, ніж гібридомна технологія, яка обмежується виробництвом невеликої кількості антитіл проти специфічних імуногенів. На противагу цьому, технологія фагового дисплею може представити цілу бібліотеку антитіл, отриманих з різних імунних видів.

Технологія фагового дисплею має широкий спектр застосування, включаючи скринінг рецепторів патогенних мікроорганізмів, вивчення взаємодії білків, відстеження передачі сигналів між клітинами, діагностику захворювань тварин та розробку вакцин, серед інших галузей.

Технологія фагового дисплею пропонує численні переваги та може застосовуватися в різних галузях. Однак основною проблемою розробки рекомбінантних антитіл за допомогою методу фагового дисплею є складність та вартість, пов'язані з цим процесом. Такий підхід вимагає інтеграції методів молекулярної біології, включаючи мутації, клонування та експресію, а також імунологічних, біохімічних та біофізичних аналізів для ідентифікації та характеристики бажаних антитіл.

Презентація антигену є дуже важливою ланкою. Методи презентації антигену включають головним чином пряму презентацію антигену в покритті, непряму презентацію антигену в покритті, презентацію антигену через скринінг цілих клітин, презентацію антигену за допомогою ліпосом, нанофосфоліпідних дисків та VLP.

Метод прямого покриття є відносно простим, але конформацію антигену легко змінити, а операція непрямого покриття є складною, але вона може підтримувати конформацію антигену та покращувати ефективність презентації. Скринінг клітин може імітувати реальну ситуацію in vivo, але існує проблема неспецифічного зв'язування. Нанофосфоліпідний диск має малий розмір, високу ефективність доставки та хорошу стабільність; VLPs зливаються з антигеном або обгортаються антигеном, що має високу імуногенність та хорошу безпеку, і може викликати сильну імунну відповідь.

Якщо концентрація занадто низька, ймовірність зв'язування з фагом зменшиться, що призведе до зниження ефективності скринінгу. І навпаки, надмірно висока концентрація може збільшити ймовірність неспецифічного зв'язування, посилити фоновий сигнал та перешкодити ідентифікації позитивних клонів.

Щоб уникнути високої температури, сильних кислот і лугів, можна використовувати метод м'якої фіксації. Для зменшення пошкодження структури антигену використовували метод непрямого покриття та систему біотин-стрептавідин. Якщо антиген є мембранним білком, його можна відобразити на поверхні інтактних клітин або використати для імітації мембранного середовища, наприклад, за допомогою нанодиска, щоб зберегти його природну конформацію мембранного білка.

На додаток до рутинних експериментів, таких як ІФА, Вестерн-блоттинг (WB) та імунофлуоресценція (IF), для моніторингу процесів зв'язування та дисоціації антитіл та антигенів у режимі реального часу можуть бути використані методи детекції за допомогою поверхневого плазмонного резонансу (SPR) та біошарової інтерферометрії (BLI), що дозволяє визначати параметри спорідненості та кінетики.

Фаговий дисплей може бути використаний для створення високоафінних моноклональних антитіл для широкого кола видів, що продукують антитіла, включаючи, але не обмежуючись, людей, мишей, щурів, кроликів, курей, верблюдів, альпак, корів, собак, овець, мавп та акул.

Технологія створення бібліотек антитіл миші є добре відома, економічно ефективна та має короткий експериментальний період, що робить її придатною для попереднього скринінгу антитіл та фундаментальних досліджень. Антитіла кроликів демонструють сильну спорідненість та специфічність, з ширшим діапазоном розпізнавання епітопів порівняно з антитілами миші. Антитіла людини можна отримати безпосередньо з бібліотек антитіл людини, тим самим уникаючи потенційних імунних реакцій, які можуть виникнути при введенні гетерологічних антитіл в організм людини. Цей підхід має значну цінність у дослідженнях та розробках ліків, зокрема у створенні терапевтичних антитіл.

Тваринні імуногени зазвичай поділяються на білковий антиген, поліпептидний антиген, антиген нуклеїнової кислоти та антиген, пов'язаний з патогеном, серед яких антиген, пов'язаний з патогеном, включає вірусний антиген (повна вірусна частинка, вірусний білок, неструктурний білок вірусу тощо), бактеріальний антиген (повний бактеріальний екстракт, компонент клітинної стінки, секретований білок, токсин тощо) та паразитарний антиген.

Скоригувати імуногени, замінивши імунні антигени рекомбінантними білками та замінивши вогнегасні вірусні частинки структурними білками вірусів. Скоригувати експериментальний дизайн та модифікувати імунну дозу.

Імуногенність можна посилити шляхом зв'язування антигенів з білками-носіями, такими як бичачий сироватковий альбумін. Крім того, для подовження часу перебування in vivo та стимуляції активації та проліферації імунних клітин можна використовувати імунні ад'юванти, включаючи ад'ювант Фрейнда та алюмінієвий ад'ювант, тим самим покращуючи імуногенність.

Бібліотека фагових антитіл — це колекція різноманітних фагових антитіл, створених шляхом збирання повного набору генів варіабельної області антитіл у фагові вектори та експресії їх на поверхні фагів. Цей процес призводить до формування бібліотеки фагових антитіл.

Загальний процес фагового дисплею включає кілька ключових етапів: екстракцію мононуклеарних клітин периферичної крові (PBMC) з імунізованих тварин, виділення загальної РНК та її транскрипцію в комплементарну ДНК (кДНК), ампліфікацію цільового гена за допомогою технології полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), клонування цільового гена у фаговий вектор та трансформацію вектора в клітину-хазяїна для експресії. Цей процес призводить до створення бібліотеки фагового дисплею, яка може швидко ідентифікувати антитіла з високою афінністю. Згодом ця бібліотека може служити цінним ресурсом для розробки вакцин, терапевтичних препаратів та діагностичних реагентів.

Залежно від джерела бібліотеки антитіл, бібліотеки фагових антитіл можна класифікувати на бібліотеки імунних фагових антитіл та бібліотеки нативних фагових антитіл. Основна відмінність між цими двома типами полягає в тому, чи були тварини вакциновані. Крім того, бібліотеки нативних антитіл можуть бути отримані шляхом напівсинтезу або синтезу.

Існує два основних показники для оцінки якості бібліотеки антитіл: ємність для зберігання та різноманітність. Велика ємність для зберігання в поєднанні з високою різноманітністю забезпечує ефективний скринінг антитіл з високою спорідненістю та специфічністю.

У процесі біологічного елюрування бібліотеку дисплеїв інкубують з фіксованими мішенями, а потім ретельно промивають для видалення нереактивних фагів. Кон'югати зазвичай елююють за допомогою кислого або високосольового розчину, а потім ампліфікують у відповідних клітинах-хазяїнах для збагачення. Після 3-5 раундів скринінгу отримують антитіла з високою афінністю.

Методи скринінгу фагів включають, головним чином, твердофазний панінг, рідкофазний скринінг та клітинний скринінг. Вибір відповідного методу скринінгу повинен враховувати характеристики цільових молекул, цілі процесу скринінгу та лабораторне середовище.

Позитивний скринінг є найфундаментальнішим методом скринінгу фагових антитіл, які зв'язуються з цільовими білками. Негативний скринінг служить для виключення неспецифічних антитіл. Під час процесу скринінгу фагових антитіл неспецифічні антитіла можуть бути ідентифіковані через перешкоди від мітки цільового антигену, матеріалів або інших антигенів зі структурною схожістю з цільовим антигеном. У таких випадках негативний скринінг може підвищити ефективність процесу скринінгу.

Методи перевірки антитіл зазвичай включають ІФА, Вестерн-блоттинг (WB), проточну цитометрію, імунопреципітацію (IP), імунофлуоресценцію (IF), імуногістохімію та різні інші експериментальні методи. Alpha Lifetech має великий досвід у виявленні антитіл та має професійну експериментальну команду, що забезпечує ефективність антитіл у наступних експериментах.