Що таке інженерія антитіл?

За допомогою інженерії антитіл стало можливим змінити молекулярний розмір, фармакокінетику, імуногенність, афінність зв’язування, специфічність і ефекторну функцію антитіл. Після синтезу антитіл специфічне зв’язування антитіл робить їх дуже цінними в клінічній діагностиці та лікуванні. Завдяки інженерії антитіл вони можуть задовольнити потреби ранньої розробки ліків і діагностики.

Метою інженерії антитіл є розробка та виробництво високоспецифічних, стабільних функцій, яких не можуть досягти природні антитіла, закладаючи основу для виробництва терапевтичних антитіл.

Alpha Lifetech, маючи великий досвід проектів у розробці антитіл, може надати індивідуальні послуги моноклональних і поліклональних антитіл для багатьох видів, а також створення бібліотеки антитіл на фаговому дисплеї та послуги скринінгу. Alpha Lifetech може надати клієнтам якісні біоподібні антитіла та рекомбінантні білкові продукти, а також відповідні послуги для виробництва ефективних, високоспецифічних і стабільних антитіл. Використовуючи комплексні антитіла, білкові платформи та системи відображення фагів, ми надаємо послуги, що охоплюють вихідний і нижчий етапи виробництва антитіл, включаючи технічні послуги, такі як гуманізація антитіл, очищення антитіл, секвенування антитіл і валідація антитіл.

Піонерська стадія розробки антитіл пов’язана з двома технологіями:

--Технологія рекомбінантної ДНК

--Гібридомна технологія

Швидкий розвиток інженерії антитіл пов’язаний з трьома важливими технологіями:

--Технологія клонування генів і полімеразна ланцюгова реакція

-- Експресія білка: рекомбінантні білки виробляються такими системами експресії, як дріжджі, паличкоподібні віруси та рослини.

--Комп'ютерне проектування конструкцій

Перше покоління антитіл було гуманізовано для виробництва химерних антитіл, де варіабельна область мишачих моноклональних антитіл була пов’язана з константною областю молекул IgG людини. Антигензв'язуючу область (CDR) мишачого моноклонального антитіла другого покоління трансплантували в людський IgG. За винятком області CDR, усі інші антитіла є майже людськими антитілами, і було докладено зусиль, щоб уникнути індукції відповіді людських антимишачих антитіл (HAMA) при використанні мишачих клонових антитіл для лікування людини.

 

Щоб побудувати бібліотеку фагового дисплея, першим кроком є ​​отримання генів, що кодують антитіла, які можна виділити з В-клітин імунізованих тварин (побудова імунної бібліотеки), екстрагувати безпосередньо з неімунізованих тварин (побудова природної бібліотеки) або навіть зібрати in vitro з фрагментами генів антитіл (побудова синтетичної бібліотеки). Потім гени ампліфікують за допомогою ПЛР, вставляють у плазміди та експресують у відповідних системах-господарях (експресія дріжджів (зазвичай Pichia pastoris), експресія прокаріотів (зазвичай E. coli), експресія клітин ссавців, експресія клітин рослин та експресія клітин комах, інфікованих паличкоподібними вірусами). Найбільш поширеною є система експресії E. coli, яка інтегрує специфічну кодуючу послідовність антитіла на фаг і кодує один із білків оболонки фага (pIII або pVIII). Злиття генів І виводиться на поверхню бактеріофагів. Суть цієї технології полягає у створенні бібліотеки фагового дисплея, яка має перевагу перед природними бібліотеками, оскільки вона може мати специфічне зв’язування. Згодом антитіла з антигенною специфічністю перевіряються за допомогою процесу біологічного відбору, цільові антигени фіксуються, незв’язані фаги багаторазово вимиваються, а зв’язані фаги вимиваються для подальшого збагачення. Після трьох або більше раундів повторення виділяють високоспецифічні та високоафінні антитіла.

Мал. 3: Створення та скринінг бібліотеки антитіл

Технологію рекомбінантної ДНК можна використовувати для створення фрагментів антитіл. Fab-антитіла спочатку можуть бути лише гідролізовані шлунковою протеазою для отримання фрагментів (Fab ') 2, які потім розщеплюються папаїном для створення окремих Fab-фрагментів. Фрагмент Fv складається з VH і VL, які мають низьку стабільність через відсутність дисульфідних зв'язків. Таким чином, VH і VL з’єднані разом за допомогою короткого пептиду з 15-20 амінокислот з утворенням одноланцюгового варіабельного фрагмента (scFv) антитіла з молекулярною масою приблизно 25 кДа.

Дослідження структури антитіл у Camelidae (Camel, LIama та Alpaca) з’ясувало, що антитіла мають лише важкі ланцюги і не мають легких ланцюгів, тому їх називають антитілами важкого ланцюга (hcAb). Варіабельний домен важких ланцюгів антитіл називається однодоменними антитілами або нанотілами або VHH розміром 12-15 кДа. Як мономери, вони не мають дисульфідних зв’язків і дуже стабільні, з дуже високою спорідненістю до антигенів.

Мал. 5: Антитіло важкого ланцюга та VHH/нанотіло

Безклітинна експресія використовує експресію природної або синтетичної ДНК для досягнення in vitro синтезу білка, як правило, з використанням системи експресії E. coli. Він швидко виробляє білки та уникає метаболічного та цитотоксичного навантаження на клітини під час виробництва великої кількості рекомбінантних білків in vivo. Він також може виробляти білки, які важко синтезувати, наприклад ті, які важко модифікувати після трансляції, або синтезувати мембранні білки.