Платформа розробки гуманізації антитіл

Гуманізовані антитіла викликають мінімальну або взагалі не викликають реакції з боку імунної системи людини. Згідно з даними Cognitive Market Research, світовий ринок гуманізації антитіл у 2024 році становитиме 92,5 мільйона доларів США і зростатиме зі складним річним темпом зростання (CAGR) 13,00% з 2024 по 2031 рік. Alpha Lifetech має зрілу платформу гуманізації антитіл з показником успішності понад 98% для гуманізованих антитіл. Ми маємо кілька стратегій гуманізації, включаючи щеплення CDR, щеплення SDR, перетасовку ланцюгів, фаговий дисплей тощо, які можна вибрати відповідно до ваших експериментальних потреб. Ми можемо не тільки забезпечити гуманізацію антитіл з різних видів, таких як миші, кролики, альпаки, верблюди тощо, але й гуманізацію антитіл у різних формах, таких як scFv, Fab та нанотіла. Ми маємо професійний технічний персонал для надання послуг з виробництва, очищення та валідації антитіл, включаючи виробництво моноклональних антитіл миші, виробництво химерних антитіл, експресію та очищення гуманізованих антитіл, а також характеристику та аналіз гуманізованих антитіл. Завдяки високому показнику успішності, високій чистоті та низькій імуногенності ми гарантуємо виробництво гуманізованих антитіл.

Вступ до гуманізації антитіл

Терапія моноклональними антитілами може бути використана для лікування аутоімунних захворювань, раку та інших захворювань. Моноклональні антитіла виробляються шляхом імунізації мишей або інших тварин. При використанні для лікування захворювань на пізній стадії виробництва моноклональних антитіл не можна ігнорувати імуногенність антитіл, що не належать до людини. Основний принцип гуманізації полягає в інтеграції залишків каркасу, що не належать до людини, таких як гіперваріабельні області, що визначають комплементарність (CDR), у каркас людського організму, що дозволяє створювати послідовності, що зберігають оригінальні характеристики антитіл, запобігаючи при цьому імуногенності. Імунізація мишей та подальша гуманізація послідовностей мишей залишаються двома основними шляхами для відкриття терапевтичних антитіл, які в основному проходять кілька стадій: виробництво антитіл мишей, химеризація моноклональних антитіл, химерні моноклональні антитіла мишей людини та процес розробки повністю гуманізованих моноклональних антитіл. Наразі дослідження в основному включають трансгенних мишей (перенесення генів В-клітин людини мишам), високопродуктивний скринінг з використанням технології дріжджового або фагового дисплею, щеплення CDR (вставка батьківських CDR у послідовності людини), трансплантаційно-специфічні залишки визначення (SDR), перетасовку каркасу та інші методи.

Рис. 1: Схематичний огляд гуманізації антитіл від мишачих антитіл (зелені домени) до повністю людських антитіл.

Стратегія гуманізації антитіл

Щеплення CDR

Щеплення CDR досягається за допомогою системи експресії ссавців, що базується на технології рекомбінантної ДНК, а її основні кроки такі:

(1) Розробити відповідні антитіла у мишах (або нелюдських джерелах), виділити ДНК, що кодує антитіла, та клонувати їх у вектори для секвенування (або безпосередньо виконати секвенування окремих клітин).

(2) Визначити послідовність ДНК, що відповідає CDR антитіла, та визначити специфічність зв'язування з мішенню;

(3) Вибрати каркасну ділянку (FR) людини для трансплантації нелюдських CDR та конструювати новий ген антитіла.

(4) Виконати тривимірний аналіз конфліктів між CDR нелюдського походження та FR людського походження для генерації відновлювальних мутацій для стабілізації петлі та запобігання втраті афінності або структурної цілісності кінцевого гуманізованого антитіла.

Рис. 2: Схематичний огляд щеплення комплементарно-визначальної області (CDR).

Перетасування фреймворку

Перестановка каркасів спирається на технологію фагового дисплею та технологію скринінгу фагових бібліотек для отримання високоафінних антитіл. Олігонуклеотиди, що кодують каркаси важких ланцюгів людських антитіл, використовуються як шаблони, CDR-ділянки кодуються як праймери, а для денатурації ПЛР-продукту та отримання одноланцюгової ДНК проводиться ПЛР-ампліфікація. Одноланцюгова ДНК генів VL та VH, очищена стрептавідином, реконструюється на векторах за допомогою ДНК-лігази Т4 та рестрикційних ферментів, інкубується з бактеріофагами та ампліфікується бактеріофагами, після чого створюється фагова бібліотека дисплеїв. Проводяться три раунди скринінгу з відповідними антигенами, а позитивні клони остаточно перевіряються за допомогою ELISA та інших методів.

Рис. 3: Схематичне зображення стратегій гуманізації пересадки комплементарно-визначальної області (CDR) та перетасовки каркасної області (FR). (A) Основна процедура пересадки CDR. (B) Основний процес перетасовки FR. (Джерело посилання: Ван Йонгмей та ін., Порівняння «перетасовки каркаса» та «щеплення CDR» у гуманізації мишачого антитіла PD-1.)

Фаговий дисплей

Виробництво гуманізованих антитіл базується на методі відображення специфічних антитіл на поверхні бактеріофагів, переважно сконструйованих за допомогою фагових бібліотек людських антитіл. Джерелом бібліотеки є PBMC, виділені з периферичної крові людини для побудови фагових бібліотек, з яких проводять скринінг відповідних послідовностей. Ця послідовність має повну людську послідовність, але отримані антитіла є фрагментами антитіл, такими як scFv, Fab та нанотіло.

Робочий процес служби гуманізації антитіл

Етапи обслуговування	Стандарт контролю якості	Хронологія
Виділення антитіл	Чистота >95%	1-2 тижні
Аналіз послідовності	Точна ідентифікація нелюдських послідовностей	1 тиждень
Щеплення CDR та щеплення каркаса	Успішна інтеграція та експресія	2-3 тижні
Вираження та очищення	Високий вихід та чистота	2-3 тижні
Функціональна валідація	Оцінка спорідненості та специфічності	1 тиждень