Дослідницька служба аптамерів

Вступ до аптамерів

Аптамери – це одноланцюгові молекули нуклеїнових кислот (таких як ДНК або РНК), які скринінгуються in vitro з бібліотеки синтетичних олігонуклеотидів з випадково призначеними послідовностями за допомогою процесу, який називається SELEX-скринінгом, що включає кілька раундів ітеративного відбору. Основні компоненти послуг з розробки аптамерів, що належать Alpha Lifetech, включають конструювання бібліотеки аптамерів, SELEX-скринінг аптамерів, SELEX-секвенування аптамерів, аналіз послідовностей аптамерів та інші види аналізу аптамерів.

SELEX-секвенування поєднує скринінг аптамерів SELEX та високопродуктивне секвенування. За допомогою SELEX-секвенування аптамерів можна ефективно визначити специфічну послідовність аптамера, зв'язаного з мішенню, що забезпечує базові дані для подальшого аналізу та застосування послідовностей аптамерів.

Аптамери широко використовуються в наукових дослідженнях, лікуванні захворювань, створенні біосенсорів, розробці ліків та моніторингу навколишнього середовища. Однак олігонуклеотидні аптамери, що пройшли скринінг in vitro, легко деградували in vivo та навіть проявляли токсичність. Тому після оптимізації перевірених аптамерів для оцінки успішності розробки аптамерів необхідний аналіз in vitro. Відповідно до різних потреб клієнтів в аналізі, Alpha Lifetech пропонує клієнтам різноманітні стратегії аналізу аптамерів на вибір.

Рис.1. Схема аналізу аптамерів. Джерело посилання:Тевендран Р., Цітартан М. 2022. Аналізи для оцінки спорідненості зв'язування аптамерів.

Вступ до служби досліджень аптамерів

Аналіз стабільності аптамерів

Експеримент з деградації нуклеаз

Шляхом інкубації аптамера з різними типами нуклеаз (такими як ДНКаза, РНКаза тощо) за певних умов спостерігають за деградацією аптамера, щоб оцінити його здатність до антидеградації. Це корисно для визначення стабільності та довговічності аптамера в практичному застосуванні.

Метод флуоресцентного мічення

Стабільність аптамера оцінюється опосередковано шляхом мічення флуорофорів на аптамері та спостереження за змінами сигналу флуоресценції до та після зв'язування з мішенню. Наприклад, коли аптамер зв'язується з мішенню, його конформація може змінитися, що призведе до посилення або зменшення сигналу флуоресценції.

Аналіз термічної стійкості

Термічна стабільність аптамера оцінюється шляхом вимірювання зміни його температури плавлення (значення Tm) за різних температур. Чим вища температура плавлення аптамера, тим краща його термічна стабільність.

Аналіз динамічної стійкості

Поверхневий плазмонний резонанс (SPR) та інші технології були використані для моніторингу процесу зв'язування та роз'єднання між аптамером і мішенню в режимі реального часу, отримання динамічних параметрів (таких як константа швидкості зв'язування, константа швидкості дисоціації тощо), подальшого розуміння механізму взаємодії між аптамером і мішенню, а також оцінки її динамічної стабільності.

Аналіз структурної стійкості

Для аналізу тривимірної структури аптамера та його структурної стабільності використовували рентгенівську кристалографію, ядерний магнітний резонанс (ЯМР) та інші методи структурної біології.

Аналіз специфічних аптамерів

Аналіз зв'язування аптамерів

Спорідненість оцінюється шляхом проведення аналізу зв'язування аптамерів для вимірювання константи зв'язування між аптамером та цільовою молекулою, такої як константа дисоціації Kd. Нижче значення Kd вказує на вищу спорідненість. Аналіз зв'язування аптамерів може відсіяти кандидати в ліки з високою здатністю до зв'язування, а потім провести подальші дослідження фармакодинаміки та фармакокінетики.

Експеримент зі зворотним скринінгом

Аналіз зворотного скринінгу – це метод скринінгу, який дозволяє швидко виключити нецільові молекули з великої кількості молекул-кандидатів. Зворотний скринінг призначений для виключення молекул, які не володіють цією властивістю або функцією. Ключем до зворотного скринінгу є вибір відповідних маркерів або умов зворотного скринінгу, які дозволяють ідентифікувати та видалити нецільові молекули під час процесу скринінгу. У цьому експерименті вибір нецільових молекул є дуже важливим. Слід переконатися, що вибрані нецільові молекули є репрезентативними для речовин, які можуть перешкоджати скринінгу аптамерів, і що можливі фактори, що заважають, охоплені якомога повніше.

Експеримент з конкурентного гальмування

Додавання надмірної кількості конкурентів (таких як молекули зі схожою структурою до цільової молекули) до системи зв'язування аптамера та цільової молекули призводить до зміни зв'язувальної здатності аптамера та цільової молекули. Якщо здатність аптамера зв'язуватися з цільовою молекулою значно знижується, це вказує на високу специфічність аптамера.

У деяких випадках експерименти з конкурентного інгібування можуть бути використані як частина або доповнення до експериментів зі зворотним скринінгом. Наприклад, у процесі скринінгу ліків здатність молекули ліків зв'язуватися з цільовим білком може бути оцінена за допомогою експериментів з конкурентного інгібування, а потім експерименти зі зворотним скринінгом можуть бути використані для видалення тих сполук, які занадто міцно зв'язані з нормальними клітинами або тканинами.

Аналіз цитотоксичності аптамерів

Існує безліч експериментальних методів аналізу цитотоксичності аптамерів, які призначені для оцінки впливу аптамерів на виживання, проліферацію або функцію клітин.

Методи	Детальний вступ	Перевага	Недолік
Метод виявлення МТТ	МТТ-аналіз – це метод, заснований на активності ферментів у мітохондріях живих клітин. Сукцинатдегідрогеназа в мітохондріях живих клітин може відновлювати екзогенний МТТ до нерозчинних у воді кристалів формазану синьо-фіолетового кольору та відкладати його в клітині, тоді як мертві клітини не мають такої функції. Розчинення цих кристалів диметилсульфоксидом (ДМСО) та визначення поглинання на певних довжинах хвиль (таких як 490 нм або 570 нм) на ферментометрі може опосередковано відображати кількість живих клітин і таким чином оцінювати цитотоксичність аптамера.	Висока чутливість, економічність та зручність	Велике робоче навантаження, органічні розчинники можуть пошкодити клітини; можна отримати лише остаточні експериментальні результати, і повний процес цитотоксичності неможливо проглянути.
Метод виявлення CCK-8	Набір для підрахунку клітин 8 (CCK-8) – це високочутливий, нерадіоактивний колориметричний метод виявлення. CCK-8 містить WST-8, який відновлюється дегідрогеназою в мітохондріях живих клітин з утворенням високорозчинного у воді помаранчевого метилзанового палива. Кількість виробленого барвника мезан лінійно залежить від кількості живих клітин, і кількість живих клітин можна опосередковано відобразити, вимірявши значення поглинання світла барвником мезан на довжині хвилі 450 нм, щоб оцінити цитотоксичність аптамера.	Просте керування, не потрібно промивати клітини, швидке виявлення, широкий лінійний діапазон виявлення, висока чутливість, хороша повторюваність, низька цитотоксичність	Висока ціна реагенту; іноді важко сказати, чи зумовлене зниження поглинання зменшенням кількості живих клітин, чи зниженням активності самої клітинної дегідрогенази.
Метод виявлення ЛДГ	ЛДГ (лактатдегідрогеназа) – це фермент, стабільний у цитоплазмі клітин, і коли клітинна мембрана пошкоджена, ЛДГ вивільняється за межі клітини. ЛДГ може каталізувати молочну кислоту з утворенням пірувату та реагувати з INT (солями тетразолію) з утворенням фіолетової кристалічної речовини. Вимірюючи його поглинання при певній довжині хвилі (наприклад, 490 нм), можна відобразити ступінь пошкодження клітин, а потім оцінити цитотоксичність аптамера.	Це безпосередньо відображає рівень смертності клітин, завдає їм менше шкоди, а також немає радіоактивного ізотопного забруднення.	Необхідність частого виймання клітин з інкубатора ускладнює операцію; можна отримати лише остаточні експериментальні результати, і повний процес цитотоксичності неможливо проглянути.
Аналіз зображень живих клітин у режимі реального часу	Використовуючи аналізатор візуалізації живих клітин у режимі реального часу, прилад було поміщено в інкубатор для спостереження та запису всього процесу циклу росту клітин у режимі реального часу. Цитотоксичність аптамерів можна оцінити, аналізуючи морфологічні зміни та криві росту клітин. Цей метод може забезпечити відео та кількісні результати цитотоксичних процесів, зберігаючи стабільність середовища росту клітин.	Він може контролювати цитотоксичний процес у режимі реального часу, використовуючи неруйнівну візуалізацію, зменшуючи перешкоди та пошкодження клітин; для поглибленого аналізу доступні як відео, так і кількісні результати.	Вартість обладнання висока та вимагає професійних навичок експлуатації та вміння аналізувати дані.