Платформа сортування окремих B-клітин

Моноклональні антитіла (mAb) як піонер антитілних препаратів, понад 100 моноклональних антитіл були схвалені для лікування раку, інфекційних захворювань, власного ринку розробки ліків та демонструють свою унікальну терапевтичну цінність. Технологія антитіл до окремих B-клітин, як нове покоління технології розробки антитіл, може ефективно та швидко виділяти антитіла з окремих B-клітин, що є проривом у технології виробництва антитіл після гібридомного та фагового дисплею. Технологія сортування окремих B-клітин може бути використана для генерації антитіл проти кількох видів, таких як кролики, миші, верблюди, вівці та кури. Технологія сортування окремих B-клітин має видатні переваги, такі як висока специфічність, висока активність та висока спорідненість. Завдяки платформі сортування окремих B-клітин, Alpha Lifetech має переваги в часі скринінгу та отриманні високоякісних антитіл. Вона може забезпечити дизайн, синтез та модифікацію антигенів, імунітет тварин, скринінг збагачення окремих B-клітин, секвенування окремих клітин, високопродуктивний скринінг, експресію та очищення, а також комплексні технічні послуги, такі як функціональна перевірка, для задоволення різноманітних потреб клієнтів.

Короткий огляд методів скринінгу окремих В-клітин

Методи скринінгу окремих B-клітин в основному поділяються на метод випадкового виділення та антигенселективне виділення. Випадкове розділення застосовується до зразків з високою концентрацією антигенселективного виділення, і відокремлюються лише B-клітини. Він простий у використанні, але вимагає багато роботи і часто використовується як перший крок антигенспецифічного розділення. Метод антигенспецифічного розділення підходить для ситуацій, коли вміст специфічних антитіл, таких як протипухлинні антитіла та аутоімунні антитіла, низький. Досить складно виділити специфічні B-клітини, використовуючи імунологічний принцип специфічного зв'язування антигену та антитіла з оригіналом. Загально використовуваний метод класифікації та його переваги та недоліки наведено в таблиці.

	Підходи	Переваги	Недоліки
Випадкове Ізоляція	Мікроманіпуляція	Низькі вимоги до обладнання Просте керування	Низька ефективність Обмежені типи ізольованих клітин
	Мікродиссекція з лазерним захопленням	Висока точність позиціонування Просте керування Візуально вибрати схожі клітини зі зразка та видалити домішки	Складний процес підготовки зразків Неможливість автоматизувати
	Сортування клітин, активоване флуоресценцією	Висока точність та ефективність Високий ступінь автоматизації Широке застосування	Складна операція Високі вимоги до обладнання
Селективна ізоляція антигену	Мічені флуорохромом антигени за допомогою багатопараметрів	Висока точність та ефективність Високий ступінь автоматизації Високопродуктивний та багатопараметричний Можливість виділення B-клітин на різних стадіях	Складна операція Високі вимоги до обладнання
	Магнітні кульки з антигенним покриттям	Просте керування Висока повторюваність Може збагачувати цільові В-клітини	Складна операція Магнітні кульки впливають на біологічну активність клітин і не сприяють культивуванню та роботі після виділення.
	Мікрогравірування	Висока ефективність Висока швидкість	Високі вимоги до обладнання Низька ефективність
	Імуноспот-матричний аналіз на чіпі	Високий ступінь автоматизації Висока точність та ефективність	Складна операція Висока вартість

Процес надання послуг з виявлення антитіл до окремих В-клітин

Імунізація тварин

Виберіть відповідний антиген для експериментальних тварин (таких як миші, кролики тощо) для імуностимуляції, щоб вони могли виробляти специфічні антитіла проти антигену.

Імунізація тварин – це початковий етап генерації антитіл. Імунізація тварин – це використання гуморального механізму імунної відповіді самого організму. Завдяки постійній стимуляції антигенами тварини виробляють сильну імунну відповідь, а потім виділяють специфічні антитіла проти певних антигенів.

Збір та збагачення В-клітин

В-клітини були виділені з периферичної крові, селезінки або лімфатичних вузлів імунних тварин. Ці В-клітини були імунологічно стимульовані для вироблення антитіл проти специфічних антигенів.

За допомогою фізичних або хімічних методів (таких як центрифугування в градієнті щільності, розділення магнітними кульками тощо) збагачуються B-клітини, видаляються домішкові клітини, покращується чистота B-клітин та ефективність подальшого розділення.

Рис.1 Клонування та отримання моноклональних антитіл кролика. Джерело посилання:Клонування окремих B-клітин та виробництво моноклональних антитіл кролика.)

сортування B-клітин

Для скринінгу окремих B-клітин від збагачених B-клітин для отримання цільових антитіл можна використовувати флуоресцентно-активоване сортування клітин (FACS), магнітне розділення клітин (MACS), мікрофлюїдний сортувальник клітин (MCS) або інші високопродуктивні методи скринінгу в поєднанні з антиген-специфічним маркуванням.

Коли окрему B-клітину виділяють із змішаної популяції B-клітин, її гени антитіл необхідно секвенувати за допомогою технології секвенування окремих клітин та проаналізувати, щоб отримати інформацію про послідовність ДНК варіабельної області важкого ланцюга (VH) та варіабельної області легкого ланцюга (VL). Технологія секвенування окремих клітин включає в себе три етапи: виділення окремих клітин, внутрішньоклітинну ампліфікацію нуклеїнових кислот та аналіз секвенування. Принцип секвенування окремих клітин полягає в ампліфікації слідів ДНК або РНК цілого геному ізольованих окремих клітин для отримання повного геному або транскриптома з високим покриттям для високопродуктивного секвенування.

Завдяки високопродуктивному скринінгу можна отримати послідовності генів антитіл тисяч B-клітин одночасно, що значно пришвидшує пошук антитіл. Цю інформацію про послідовності можна надалі використовувати для створення та скринінгу бібліотек антитіл.

Рис. 2. Схематична діаграма захоплення окремих B-клітин, створення бібліотеки, високопродуктивного скринінгу та секвенування.(Джерело посилання: Масово паралельне секвенування рецепторів B-клітин окремих клітин дозволяє швидко виявляти різноманітні антиген-реактивні антитіла.)

Ампліфікація генів антитіл

Одну B-клітину розщеплюють для вивільнення мРНК. Потім послідовності кДНК варіабельної області важкого ланцюга (VH) та варіабельної області легкого ланцюга (VL) ампліфікують за допомогою полімеразної ланцюгової реакції зворотної транскрипції (RT-PCR).

Експресія та очищення антитіл

Ампліфікований ген варіабельної області був вставлений у векторну плазміду з геном константної області для конструювання плазміди експресії моноклональних антитіл. Потім для експресії була обрана відповідна система експресії (еукаріотична система експресії, така як клітини CHO, або прокаріотична система експресії, така як Escherichia coli), і отримано моноклональне антитіло з біологічною активністю. Афінна хроматографія на білку А була використана для екстракції та очищення експресованих антитіл з клітинної культури та отримання високоякісних рекомбінантних моноклональних антитіл.

Валідація антитіл

Валідація специфічності, афінності та біологічної активності антитіл за допомогою ELISA, вестерн-блоттингу, проточного аналізу та імунокопіпітації, щоб переконатися, що ефективність антитіл відповідає очікуванням. Валідація антитіл є ключовим кроком у забезпеченні якості та надійності антитіл.

Вимоги до імуногену

(1) Рекомбінантний білок: ≥2,5 мг, чистота білка >85%, молекулярна маса білка більше 10 кДа, концентрація розчинного білка від 0,5 до 5 мг/мл. Якщо потрібне очищення за спорідненістю антигену, потрібно додатково 10 мг рекомбінантного білка.

(2) Поліпептиди та малі молекули: чистий пептид ≥10 мг, чистота пептиду >90%, не менше 10 AA, зв'язування KLH/BSA/OVA або інших білків-носіїв; малі молекули потребують попередньої структурної оцінки.

Робочий процес служби сортування окремих B-клітин

Кроки	Зміст послуги	Хронологія
Крок 1: Імунізація тварин та виявлення за допомогою ІФА	(1) Тварин імунізували 4-5 разів, починаючи з 4-ї дози, збирали сироватку для визначення титру антитіл методом ІФА (титр сироватки білкового антигену ІФА >10^5; титр сироватки пептидного антигену ІФА >10^4). Одночасно клієнтам надсилаються 0,1 мл сироватки для пре- та пост-імунізаційного аналізу; якщо титр не відповідає вимогам, імунізація продовжиться або клієнт просить про припинення проекту, і плата буде стягнута лише за частину, що була здійснена за імунізацію; (2) Якщо титр був кваліфікований, клітини PBMC виділяли з цільної крові.	10-12 тижнів
Крок 2: Сортування окремих B-клітин	(1) Було зібрано селезінку, приготовано суспензію окремих B-клітин, зібрано периферичну кров та виділено клітини PBMC. (2) Імуноантигенні маркери FITC та AF648. (3) Подвійне сортування флуоресцентного потоку + культивування одного клону B-клітин. (4) ІФА-ідентифікація + секвенування позитивних клонів.	2-3 тижні
Крок 3: Експресія та валідація антитіл	(1) Синтез генів 6-10 послідовностей + валідація тесту експресії у ссавців. (2) Ідентифікація за допомогою ІФА.	3-4 тижні
Крок 4: Доставка	(1) Послідовності антитіл: 4-6 послідовностей антитіл (неекспресовані послідовності доставляють разом). (2) Кожна експресована послідовність доставляла 0,2 мг антитіла. (3) Експериментальний звіт.	1 тиждень