Служба скринінгу бібліотеки поверхневих дисплеїв дріжджів

Alpha Lifetech спеціалізується на створенні бібліотек дріжджових дисплеїв та скринінгу бібліотек антитіл, пропонуючи можливість генерувати різні форми бібліотек дріжджів та скринінгувати їх на наявність високоафінних та специфічних антитіл для клієнтів у всьому світі. Завдяки команді досвідчених дослідників, передовим технологіям та обладнанню, ми можемо створювати бібліотеки дріжджів, спрямовані на широкий спектр білків, пов'язаних із захворюваннями. Ми можемо запропонувати технології фагового дисплея та дріжджового дисплея, включаючи дріжджовий дисплей білків, дріжджовий дисплей низьких молекул, дріжджовий дисплей антитіл тощо.

Наші бібліотеки дріжджових дисплеїв мають велику ємність та високу різноманітність, що забезпечує надійну основу для ефективного скринінгу специфічних послідовностей антитіл. Ми можемо створювати різні форми бібліотек дріжджових дисплеїв антитіл (бібліотеки антитіл IgG, scFv, VHH, Fab), бібліотеки білків, бібліотеки пептидів, бібліотеки кДНК тощо відповідно до ваших потреб. Крім того, ми також можемо розробляти бібліотеки антитіл різних властивостей, включаючи імунні бібліотеки, природні бібліотеки, синтетичні бібліотеки, напівсинтетичні бібліотеки та бібліотеки антитіл до захворювань.

Вступ до системи відображення дріжджів

Технологія дисплея на поверхні дріжджів – це метод відображення рекомбінантних білків на поверхні дріжджів шляхом злиття генів. Найпоширеніша система дисплея дріжджів використовує цільовий білок, злитий з C-кінцем субодиниці Aga2p білка, що сполучає альфа-лектин, що складається переважно з епітопних міток з обох боків цільового білка: N-кінцевої мітки гемаглютиніну (HA) з 9 амінокислот та C-кінцевої мітки c-myc з 10 амінокислот. Субодиниця Aga2p з 69 амінокислот зв'язується з субодиницею Aga1p альфа-лектину з 725 амінокислот через два дисульфідні зв'язки, а Aga1p закріплений на клітинній стінці через ковалентний зв'язок β 1,6-глюкан. Таким чином, цільовий білок відображається на поверхні клітин дріжджів і згодом розпізнається відповідним лігандом. Відокремте функціональні білки від бібліотек за допомогою проточного цитометричного скринінгу.

Рис. 1: Принцип відображення поверхні дріжджів. (Джерело рисунка: Застосування дисплеїв поверхні дріжджів для білкової інженерії.)

Вступ до бібліотеки відображення поверхні дріжджів

Сортування дріжджів за допомогою дисплея базується на дисплеї поверхні дріжджів, який використовується переважно для скринінгу бібліотек антитіл, спрямованих на білки клітинної поверхні. Завдяки низькому неспецифічному зв'язуванню між дріжджовими клітинами та іншими клітинними поверхнями, біологічна селекція дріжджів може скринінгувати великі бібліотеки зв'язування, щоб знайти рідкісні клони.

Служба скринінгу бібліотеки поверхневих дисплеїв дріжджів

Підготуйте плазміди та культивуйте клітини дріжджів, синтезуйте ДНК, що кодує цільовий білок, та клонуйте її у вектор експресії дріжджів, що містить індуцибельні промотори, сигнальні пептиди та цільові гени, злиті з поверхневими білками дисплея (такими як Aga2p). Ген, що кодує цільовий білок, може бути злитий з геном, що кодує білок клітинної стінки дріжджів (зазвичай Aga2p), і злитий ген може бути трансформований у клітини дріжджів за допомогою електропорації. Після трансформації клітини дріжджів, що експресують гени антитіл на своїй поверхні, можуть пройти антиген-специфічні скринінгові тести: бібліотеку дріжджів інкубують з цільовим антигеном, і відбирають клітини дріжджів, які специфічно зв'язуються з ним. Використовуючи сортування клітин, активованих флуоресценцією (FACS), для виділення клітин дріжджів, що демонструють білки з бажаними характеристиками, можна проводити скринінг бібліотеки дріжджів з максимальним розміром бібліотеки ~10^8-10^9 клітин дріжджів. Позитивні клони потім можна виділити для подальшого аналізу або подальшого застосування. Після того, як специфічні клони антитіл ідентифіковані з бібліотеки антитіл, їх можна додатково охарактеризувати та масово виробляти, а також очистити за допомогою таких методів, як афінна хроматографія білка A/G, щоб завершити весь процес скринінгу дріжджів на дисплей та виробництва антитіл.

Процес скринінгу бібліотеки дріжджів

Рис.2 Процес скринінгу бібліотеки дріжджових дисплеїв

Робочий процес служби скринінгу бібліотеки дріжджів

Кроки	Зміст послуги	Хронологія
Підготовка антигену	Тип антигену: Якщо замовник може надати антигени, відповідні зразки необхідно доставити відповідно до типу: рекомбінантні білки потребують 3-3,5 мг з вимогою щодо чистоти понад 85%, малі молекули повинні бути кон'юговані з вимогою щодо чистоти понад 90%, синтез пептидів повинен бути кон'югований з вимогою щодо чистоти понад 90%, такі типи зразків, як віруси, повинні бути інактивовані, РНК необхідно перевірити, щоб запобігти деградації, а вищезазначені типи антигенів також можуть бути налаштовані для синтезу.	2-3 тижні
Імунітет тварин	Кількість імунізацій тварин становить 5, і необхідно визначити, чи слід збільшувати кількість імунізацій, на основі визначення титру сироватки. Антигенний імунітет: активність білкового/вірусного антигену > 105; активність пептидного/маломолекулярного антигену > 10^4	5-6 тижнів
Підготовка шаблонної кДНК	Відокремте плазмові PBMC, екстрахуйте загальну РНК (набір для екстракції РНК) та конвертуйте до кДНК.	1 день
Будівництво бібліотеки	Використовуючи кДНК бібліотеки як шаблон, ген VHH був ампліфікований за допомогою двох раундів ПЛР, і був сконструйований вектор дріжджового дисплея сплайсингу гена VHH. Вектор був трансформований у дріжджові клітини за допомогою електропорації для створення бібліотеки антитіл. Випадковим чином відібрано 48 клонів та визначено рівень позитивного результату (>90%) за допомогою методу ПЛР; обчислено місткість бібліотеки (10^7-10^8), проведено секвенування NGS для визначення правильного рівня вставки бібліотеки (>90%) та різноманітності бібліотеки.	2 тижні
Бібліотечний скринінг	Три раунди скринінгу за замовчуванням: скринінг флуоресцентно мічених білків за допомогою FACS, а потім NGS-секвенування в третьому раунді. Позитивні клони були відібрані для індукційної експресії в одному грамі та детекції ELISA. Всі позитивні клони були відібрані для секвенування генів, і були відібрані різні послідовності CDR-ділянки.	2-3 тижні
Перевірка антитіл	Конструювання відповідних векторів експресії для послідовностей антитіл може полегшити експресію антитіл, очищення антитіл, ELISA та BLI-валідацію зв'язування антитіл з антигеном для перевірки афінності антитіл, а також блокаду проточної цитометрії для підтвердження функції клітин.	1 тиждень

Випадок скринінгу бібліотеки поверхневого дисплея дріжджів

У літературі, що стосується платформи для поверхневого дисплею дріжджів для швидкого виявлення конформаційно селективних нанотіл, автори створили повну платформу для виявлення нанотіл in vitro на основі поверхневого дисплею дріжджів. Спочатку була розроблена бібліотека синтетичних нанотіл, починаючи з генів верблюда. На рисунку D показано, що нанотіло має HA-мітку на карбоксильному кінці, а потім нанотіло ковалентно фіксується на клітинній стінці дріжджів. На рисунку E показано процес скринінгу нанотіл. Дріжджі з нанотілами, спорідненими до антигену, були виділені, ампліфіковані та багаторазово відібрані на наявність антитіл за допомогою FACS. Автори виявили конформаційно селективні нанотіла, що націлені на два різні людські GPCR, за допомогою цієї платформи.