Nền tảng đo lường ái lực

Dựa trên nền tảng Octet và Biacore-T2000, Alpha Lifetech có thể cung cấp dịch vụ xác định ái lực đáng tin cậy. Chúng tôi có thể thực hiện xác định ái lực cho nhiều loại mẫu, chẳng hạn như kháng thể, tế bào, protein, phân tử nhỏ, v.v. Có nhiều phương pháp xác định ái lực khác nhau, bao gồm xác định ái lực bằng cộng hưởng plasmon bề mặt (SPR) và giao thoa lớp sinh học (BLI).

Alpha Lifetech sở hữu nền tảng xác định ái lực chuyên nghiệp và chính xác, kết hợp ELISA với xác định ái lực, cung cấp kết quả xác định ái lực chuyên nghiệp, hiệu quả, nhanh chóng và chính xác cho khách hàng trên toàn thế giới. Chúng tôi cung cấp hai phương pháp cho khách hàng lựa chọn: Xác định ái lực nhanh và Xác định ái lực chính xác. Xác định ái lực nhanh là xác định ở một nồng độ duy nhất, trong khi xác định ái lực chính xác có thể đo ái lực ở các nồng độ khác nhau. Ứng dụng trong nghiên cứu tương tác giữa các hợp chất phân tử nhỏ khác nhau, peptit, protein, oligonucleotide và oligomer, cũng như lipid, thực khuẩn thể, virus và tế bào. Nền tảng đo lường ái lực có thể đặt nền tảng cho thử nghiệm và sàng lọc thuốc dựa trên ái lực, phát hiện kháng thể và tạo điều kiện thuận lợi cho các nghiên cứu tiếp theo.

Giới thiệu về ái lực liên kết

Độ ái lực rất quan trọng trong việc đánh giá tương tác giữa các phân tử, xét nghiệm độ ái lực của thuốc và sàng lọc thuốc. Tương tác giữa các phân tử có thể được mô tả bằng phương trình: L + R = LR, trong đó L đại diện cho các phối tử tự do, R đại diện cho các thụ thể không liên kết, và LR đại diện cho các phức hợp phối tử-thụ thể liên kết. Phản ứng liên kết xác định tương tác giữa các phân tử, trong đó sự trao đổi động xảy ra giữa trạng thái liên kết và không liên kết trong suốt phản ứng cho đến khi đạt trạng thái cân bằng. Điều này có thể được mô tả bằng hai hằng số tốc độ, Kon (hằng số tốc độ liên kết) và Koff (hằng số tốc độ phân ly), của phản ứng. Giá trị Kd, là nghịch đảo của hằng số liên kết (Ka), là Koff/Kon, một hằng số quan trọng đối với độ ái lực của phản ứng. Do đó, sự liên kết giữa hai phân tử càng chặt chẽ thì độ ái lực càng cao. Giá trị Kd càng nhỏ thì ngược lại. Phương trình này có thể được biểu diễn dưới dạng đường cong hình chữ S trên đồ thị bán logarit, với nồng độ phối tử trên trục x (trên trục thang logarit) và ranh giới phân số trên trục y. Đường nét đứt biểu thị nồng độ phối tử ở Kd (1 nM) với tỷ lệ liên kết là 0,5.

Hình 1: Đường cong liên kết hình chữ S của các nồng độ phối tử khác nhau liên kết với thụ thể bề mặt tế bào. (Nguồn tham khảo: Hunter SA, Cochran JR. Các xét nghiệm liên kết tế bào để xác định ái lực của tương tác protein-protein: Công nghệ và những cân nhắc.)

Các phương pháp xác định ái lực

xét nghiệm ái lực liên kết ELISA

Kỹ thuật được sử dụng rộng rãi để nghiên cứu ái lực kháng thể dựa trên phương pháp ELISA, đặc trưng bởi sự tiện lợi, tốc độ, đơn giản, độ nhạy cao và tính đặc hiệu mạnh. Phương pháp này có thể sử dụng một lượng nhỏ thuốc thử (ví dụ: kháng thể và kháng nguyên) và đo ái lực kháng thể mà không cần đến các thuốc thử tinh chế. Bằng cách cố định kháng nguyên trên một bề mặt rắn và phát hiện nó bằng kháng thể chính, kháng thể phụ được gắn nhãn sẽ phản ứng với kháng thể chính để đọc và phân tích dữ liệu trong máy đọc ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay).

Hình 2: Các xét nghiệm tương tự ELISA để đánh giá sự liên kết của các peptide được thiết kế với các mục tiêu của chúng. (Nguồn tham khảo: Hajikarimlou, Maryam, và cộng sự, 2022. Một phương pháp tính toán để nhanh chóng thiết kế các peptide phát hiện protein bề mặt S của SARS-CoV-2.)

Xét nghiệm ái lực liên kết cộng hưởng plasmon bề mặt (SPR)

Công nghệ SPR chủ yếu phát hiện sự thay đổi chỉ số khúc xạ. Nhờ các hiện tượng quang học truyền thống và hiện tượng cộng hưởng ánh sáng, một công nghệ phân tích cảm biến sinh học về tương tác giữa các phân tử sinh học có thể được xây dựng để phát hiện sự tương tác giữa các phối tử và chất phân tích trên các chip cảm biến sinh học. Các tín hiệu đặc hiệu về sự liên kết và tương tác giữa các phân tử sinh học có thể thu được bằng cách theo dõi sự thay đổi động học của góc SPR trong các phản ứng sinh học.

Hình 3: Phân tích cộng hưởng plasmon bề mặt (SPR) của sự liên kết H10/AGR2. (Nguồn tham khảo: Garri, Carolina, và cộng sự, 2018. Xác định, đặc trưng hóa và ứng dụng một peptide mới chống lại đồng đẳng gradient trước 2 (AGR2).)

Thử nghiệm ái lực liên kết bằng phương pháp can thiệp lớp sinh học (BLI)

Công nghệ nhiễu loạn màng sinh học là một kỹ thuật phát hiện quang học theo dõi thời gian thực, không cần chất đánh dấu, chủ yếu được sử dụng để phân tích định lượng toàn diện các tương tác giữa các phân tử và xác định nồng độ protein. Công nghệ này sử dụng cảm biến sinh học dựa trên đầu dò để trực tiếp phát hiện sự thay đổi độ dày của màng sinh học trên mẫu. Bằng cách phát hiện sự thay đổi độ dịch chuyển của phổ nhiễu loạn, sự liên kết và phân ly giữa các phân tử sinh học tương tác trên bề mặt cảm biến được phát hiện, và độ dịch chuyển (nm) của phổ nhiễu loạn được hiển thị theo thời gian thực.

Hình 4: Thí nghiệm giao thoa lớp sinh học (BLI) giữa aLDRG và chitinoligosaccharide. (Nguồn tham khảo: Li, Bing, 2023. Đặc điểm nổi bật của hệ gen so sánh giữa rễ giả và sợi nấm của Armillaria sp. 541 tham gia cộng sinh nấm, nhấn mạnh vào các miền LysM.)

So sánh công nghệ BLI và SPR

Tên công nghệ	BLI (Giao thoa lớp sinh học)	SPR (Cộng hưởng Plasmon bề mặt)
Nguyên tắc	Thiết bị này đo lường sự thay đổi trong mô hình giao thoa của ánh sáng phản xạ trên bề mặt cảm biến, phát hiện các tương tác phân tử thông qua sự thay đổi độ dày quang học trên lớp sinh học. Nó cung cấp đường cong liên kết theo thời gian thực (đo trực tiếp).	Thiết bị này đo lường tương tác phân tử bằng cách phát hiện sự thay đổi tín hiệu trong chỉ số khúc xạ gần bề mặt chip cảm biến (xảy ra khi ánh sáng tương tác với giao diện vàng và thủy tinh, gây ra sự thay đổi trong chỉ số khúc xạ). Dữ liệu được phản ánh dưới dạng sự thay đổi trong góc cộng hưởng (phép đo gián tiếp).
Nhà sản xuất	Sartorius	GE
Dụng cụ	Cảm biến sinh học ForteBio	Thiết bị SPR mở
Hệ thống	Hệ thống ForteBio Octet (dùng để phân tích tương tác phân tử)	TraceDrawer (được phát triển bởi Ridgeview Instruments, Thụy Điển)
Thuận lợi	1. Khả năng tương thích mẫu rộng, độ ổn định tuyệt vời, đặc biệt là trong việc phát hiện các phân tử nhỏ (yêu cầu cụ thể về độ tinh khiết của mẫu và điều kiện dung dịch đệm ít nghiêm ngặt hơn). Chip SSA tiết kiệm chi phí cho các nghiên cứu về liên kết. 2. Tốc độ xử lý nhanh hơn và thời gian thí nghiệm ngắn hơn so với SPR.	1. Có lịch sử phát triển lâu dài hơn, mang lại độ nhạy cao hơn so với BLI. 2. Độ chính xác và độ bền cao hơn cho các ứng dụng cụ thể, chẳng hạn như phát hiện các protein hiếm hoặc có giá trị với dữ liệu về ái lực và tính đặc hiệu cao hơn.
Nhược điểm	1. Độ chính xác dữ liệu thấp hơn một chút so với SPR. 2. Cần bảo dưỡng thiết bị cẩn thận. 3. Chi phí chip SSA tương đối cao.	1. Điều kiện đệm để phát hiện các phân tử rất nhỏ có thể rất khắt khe, làm tăng nguy cơ thất bại trong quá trình phát hiện. 2. Các chip này thường đắt hơn so với các chip được sử dụng trong BLI. 3. Sự bay hơi mẫu trong các thí nghiệm kéo dài có thể là một vấn đề.
Loại chip	Chip SSA	Chip NTA

Phạm vi đo lường ái lực

Việc xác định ái lực có thể bao gồm kháng nguyên-kháng thể (kháng nguyên-kháng thể mạnh, kháng nguyên-kháng thể yếu), protein-protein, protein-peptide, protein-phân tử nhỏ và protein-DNA/RNA (aptamer). Khi đo KD, cần phải biết một trong các nồng độ mol. Khi các phân tử nhỏ liên kết, trọng lượng phân tử của một phân tử không được nhỏ hơn 150 dalton.

Kiểu	Phạm vi	Các biện pháp phòng ngừa
1. Kháng nguyên-Kháng thể	10^-6 đến 10^-12	Giá trị Kd của hầu hết các kháng thể nằm trong khoảng 10^-6, 10^-7 đến 10^-9. Người ta thường cho rằng các kháng thể có ái lực cao nằm trong khoảng 10^-9, trong khi các kháng thể có ái lực thấp nằm trong khoảng 10^-12.
2. Protein - Phân tử nhỏ	10^-4 đến 10^-5	Giá trị KD của các phân tử nhỏ và protein nằm trong khoảng từ 10^-4 đến 10^-5, trong khi 10^-3 đến 10^-7 là bình thường và không thể đạt đến 10^-10. Số lượng phân tử nhỏ liên kết cộng hóa trị có thể đạt tới 10^-10.
3. Avidin-Biotin	10^-14	Affinity có thể dễ dàng trải qua quá trình liên kết không đặc hiệu, và có thể sử dụng streptavidin hoặc chất ái lực đã loại bỏ đường.
4. DNA-Protein	10^-8 đến 10^-10	ADN chất lượng cao và đầy đủ; cần cẩn thận để tránh ảnh hưởng của điện di.

Yêu cầu mẫu để xác định ái lực

Vật mẫu	Yêu cầu
1. Mẫu phân tử lớn	Protein > 50 µg, kháng thể > 100 µg, protein gắn biotin > 200 µg; protein không gắn biotin > 2 mg, yêu cầu độ tinh khiết > 90%, dung dịch đệm: PBS, HEPBS. Không được chứa nhóm imidazole; cần có kiểm soát chất lượng.
2. Mẫu phân tử nhỏ	Lượng >1mg, dạng bột hoặc lỏng, dạng lỏng cần hòa tan trong nước hoặc DMSO. Cố gắng không chứa glycerol, imidazole, trehalose hoặc các muối khác; cố gắng tránh các chất phản ứng có nhóm amino như Tris trong dung dịch đệm, nói chung là PBS, HEPPS, v.v. mà không có chất phản ứng hữu cơ.

Ưu điểm của nền tảng đo lường ái lực

Phân tích nhiều mẫu

Alpha Lifetech có thể cung cấp các xét nghiệm ái lực cho nhiều loại mẫu khác nhau, bao gồm kháng thể, tế bào, protein và các phân tử sinh học khác.

Nền tảng công nghệ trưởng thành

Chúng tôi sở hữu các công nghệ tiên tiến như xét nghiệm liên kết SPR, xét nghiệm liên kết BLI và xét nghiệm liên kết ELISA.

Lựa chọn dự án linh hoạt

Khách hàng có thể lựa chọn giữa phương pháp xác định ái lực nhanh và phương pháp xác định ái lực chính xác.

Kết quả có độ chính xác cao

Đội ngũ kỹ thuật chuyên nghiệp của chúng tôi có thể đảm bảo kết quả xác định ái lực hiệu quả, chính xác và đáng tin cậy.

Nghiên cứu trường hợpTRƯỜNG HỢP

Xét nghiệm ái lực nhanh BLI, xét nghiệm ái lực kháng thể và aptamer.

Thu giữ các aptamer được biotin hóa với độ đặc hiệu của đầu dò SA và hòa tan chúng. Hòa tan và pha loãng mẫu đến nồng độ cố định, làm đông đặc các aptamer Mục tiêu 1-5 được thu giữ đặc hiệu với đầu dò, và sau khi tín hiệu bão hòa, liên kết với mẫu. Sau đó cho chúng vào đĩa 96 giếng.

Hình 5: Phân bố vị trí phát hiện cho các mẫu trên đĩa 96 giếng. B đề cập đến dung dịch đệm được sử dụng để cân bằng và phân tách các cảm biến. L: Aptamer Biotin Target 1-5, 221: Mẫu.

Hãy chú ý đến quá trình khoan để đảm bảo tính ổn định và chính xác của dữ liệu, đồng thời thiết lập chương trình tương ứng để thu được kết quả:

Hình 6: Sơ đồ khớp tương tác giữa các aptamer Mục tiêu 1, 2 và 3 với các mẫu. (CH 1 \ 3 \ 5 biểu thị tín hiệu và dữ liệu tương tác giữa đầu dò aptamer Mục tiêu 1 \ 2 \ 3 đã đông đặc và mẫu.)

Hình 7: Sơ đồ khớp tương tác giữa aptamer Mục tiêu 4 và 5 với mẫu. (CH 1 \ 3 biểu thị tín hiệu và dữ liệu tương tác giữa đầu dò aptamer Mục tiêu 4 \ 5 đã đông đặc và mẫu.)

kết quả cho thấy

Các kết quả thu được như sau: Độ ái lực của bộ chuyển đổi Mục tiêu 1 với mẫu sau khi lắp ráp là 9,41 ^ -8; độ ái lực của bộ chuyển đổi Mục tiêu 2 với mẫu sau khi lắp ráp là 8,32 ^ -8; độ ái lực của bộ chuyển đổi Mục tiêu 3 với mẫu sau khi lắp ráp là 8,64 ^ -8; độ ái lực của bộ chuyển đổi Mục tiêu 4 với mẫu sau khi lắp ráp là 3,70 ^ -8; độ ái lực của bộ chuyển đổi Mục tiêu 5 với mẫu sau khi lắp ráp là 3,01 ^ -8.

Nếu có bất kỳ thắc mắc nào, xin vui lòng liên hệ với chúng tôi bất cứ lúc nào.

Leave Your Message

Dịch vụ nổi bật

0102