Công nghệ hiển thị phage là phương pháp chèn gen mục tiêu ngoại lai vào vị trí cụ thể của protein vỏ phage, và biểu hiện gen ngoại lai trên bề mặt phage mà không ảnh hưởng đến chức năng bình thường của phage. Sau nhiều vòng sàng lọc, cuối cùng thu được protein mục tiêu có tính đặc hiệu cao và hoạt tính sinh học cao.

Công nghệ này cho phép tạo ra các thư viện kháng thể dung lượng lớn. Chu kỳ sàng lọc ngắn, quy trình vận hành đơn giản và phạm vi ứng dụng rộng rãi, cho phép xác định các trình tự tối ưu cho các peptide hoặc protein mục tiêu. Trong các ứng dụng liên quan đến virus, các nhà nghiên cứu có thể phát hiện ra các kháng thể liên kết với các epitope quan trọng của virus bằng cách sàng lọc các thư viện kháng thể lớn. Quá trình này có thể cản trở sự xâm nhập, nhân lên hoặc các cơ chế né tránh miễn dịch của virus, từ đó tạo nền tảng cho việc điều trị bệnh.

Công nghệ hiển thị phage được sử dụng rộng rãi hơn so với công nghệ lai tế bào (hybridoma), vốn chỉ giới hạn ở việc sản xuất một lượng nhỏ kháng thể chống lại các chất gây miễn dịch cụ thể. Ngược lại, công nghệ hiển thị phage có thể trình bày toàn bộ thư viện kháng thể có nguồn gốc từ nhiều loài miễn dịch khác nhau.

Công nghệ hiển thị phage có phạm vi ứng dụng rộng rãi, bao gồm sàng lọc các thụ thể của vi sinh vật gây bệnh, nghiên cứu tương tác protein, theo dõi sự truyền tín hiệu giữa các tế bào, chẩn đoán bệnh ở động vật và phát triển vắc-xin, cùng nhiều lĩnh vực khác.

Công nghệ hiển thị phage mang lại nhiều ưu điểm và có thể được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực. Tuy nhiên, thách thức chính trong việc phát triển kháng thể tái tổ hợp bằng phương pháp hiển thị phage là sự phức tạp và chi phí cao của quy trình. Phương pháp này đòi hỏi sự tích hợp các kỹ thuật sinh học phân tử, bao gồm đột biến, nhân bản và biểu hiện, cùng với các phân tích miễn dịch học, sinh hóa và lý sinh để xác định và đặc trưng hóa các kháng thể mong muốn.

Trình diện kháng nguyên là một khâu rất quan trọng. Các phương pháp trình diện kháng nguyên chủ yếu bao gồm trình diện kháng nguyên phủ trực tiếp, trình diện kháng nguyên phủ gián tiếp, trình diện kháng nguyên thông qua sàng lọc toàn bộ tế bào, trình diện kháng nguyên thông qua liposome, đĩa nano-phospholipid và VLP.

Phương pháp phủ trực tiếp tương đối đơn giản, nhưng cấu trúc kháng nguyên dễ bị thay đổi, còn phương pháp phủ gián tiếp phức tạp hơn, nhưng có thể duy trì cấu trúc kháng nguyên và nâng cao hiệu quả trình bày. Sàng lọc tế bào có thể mô phỏng tình trạng thực tế trong cơ thể sống, nhưng lại gặp vấn đề về liên kết không đặc hiệu. Đĩa nano-phospholipid có kích thước nhỏ, hiệu quả vận chuyển cao và độ ổn định tốt; VLP được kết hợp với kháng nguyên hoặc được bao bọc bởi kháng nguyên, có tính sinh miễn dịch cao và an toàn tốt, có thể kích hoạt phản ứng miễn dịch mạnh mẽ.

Nếu nồng độ quá thấp, khả năng liên kết với phage sẽ giảm, dẫn đến hiệu quả sàng lọc bị giảm. Ngược lại, nồng độ quá cao có thể làm tăng khả năng liên kết không đặc hiệu, làm tăng tín hiệu nền và cản trở việc xác định các dòng vô tính dương tính.

Có thể áp dụng phương pháp cố định nhẹ nhàng để tránh nhiệt độ cao, axit và kiềm mạnh. Phương pháp phủ gián tiếp và hệ thống biotin-streptavidin được sử dụng để giảm thiểu sự phá hủy cấu trúc kháng nguyên. Nếu kháng nguyên là protein màng, nó có thể được hiển thị trên bề mặt của các tế bào nguyên vẹn hoặc được sử dụng để mô phỏng môi trường màng, chẳng hạn như đĩa nano, để duy trì cấu trúc protein màng tự nhiên của nó.

Bên cạnh các thí nghiệm thường quy như ELISA, Western Blotting (WB) và Immunofluorescence (IF), các kỹ thuật phát hiện Surface Plasmon Resonance (SPR) và Bio-Layer Interferometry (BLI) có thể được sử dụng để theo dõi quá trình liên kết và phân ly của kháng thể và kháng nguyên trong thời gian thực, cho phép xác định các thông số về ái lực và động học.

Kỹ thuật hiển thị phage có thể được sử dụng để tạo ra các kháng thể đơn dòng có ái lực cao đối với nhiều loài sản sinh kháng thể, bao gồm nhưng không giới hạn ở người, chuột, chuột cống, thỏ, gà, lạc đà, lạc đà alpaca, bò, chó, cừu, khỉ và cá mập.

Công nghệ xây dựng thư viện kháng thể chuột đã được thiết lập tốt, tiết kiệm chi phí và có thời gian thí nghiệm ngắn, phù hợp cho việc sàng lọc kháng thể sơ bộ và nghiên cứu cơ bản. Kháng thể thỏ thể hiện ái lực và tính đặc hiệu mạnh, với phạm vi nhận diện epitope rộng hơn so với kháng thể chuột. Kháng thể người có thể được thu nhận trực tiếp từ thư viện kháng thể người, do đó tránh được các phản ứng miễn dịch tiềm ẩn có thể xảy ra khi sử dụng kháng thể khác loại cho cơ thể người. Phương pháp này có giá trị đáng kể trong nghiên cứu và phát triển thuốc, đặc biệt là trong việc tạo ra các kháng thể điều trị.

Các chất sinh miễn dịch ở động vật thường được chia thành kháng nguyên protein, kháng nguyên polypeptide, kháng nguyên axit nucleic và kháng nguyên liên quan đến tác nhân gây bệnh, trong đó kháng nguyên liên quan đến tác nhân gây bệnh bao gồm kháng nguyên virus (hạt virus hoàn chỉnh, protein virus, protein không cấu trúc của virus, v.v.), kháng nguyên vi khuẩn (chiết xuất vi khuẩn hoàn chỉnh, thành phần vách tế bào, protein tiết ra, độc tố, v.v.) và kháng nguyên ký sinh trùng.

Điều chỉnh các chất sinh miễn dịch bằng cách thay thế kháng nguyên miễn dịch bằng protein tái tổ hợp và thay thế các hạt virus chống cháy bằng protein cấu trúc của virus. Điều chỉnh thiết kế thí nghiệm và sửa đổi liều lượng miễn dịch.

Khả năng sinh miễn dịch có thể được tăng cường bằng cách kết hợp kháng nguyên với các protein mang, chẳng hạn như albumin huyết thanh bò. Ngoài ra, các chất bổ trợ miễn dịch, bao gồm chất bổ trợ Freund và chất bổ trợ nhôm, có thể được sử dụng để kéo dài thời gian lưu trú trong cơ thể và kích thích sự hoạt hóa và tăng sinh của các tế bào miễn dịch, từ đó cải thiện khả năng sinh miễn dịch.

Thư viện kháng thể thực khuẩn là một tập hợp các kháng thể thực khuẩn đa dạng được tạo ra bằng cách lắp ráp một bộ gen vùng biến đổi hoàn chỉnh từ các kháng thể vào các vectơ thực khuẩn và biểu hiện chúng trên bề mặt của thực khuẩn. Quá trình này dẫn đến sự hình thành thư viện kháng thể thực khuẩn.

Quy trình chung của phương pháp hiển thị phage bao gồm một số bước chính: chiết xuất tế bào đơn nhân máu ngoại vi (PBMC) từ động vật được miễn dịch, phân lập tổng RNA và phiên mã thành DNA bổ sung (cDNA), khuếch đại gen mục tiêu bằng công nghệ phản ứng chuỗi polymerase (PCR), nhân bản gen mục tiêu vào vectơ phage, và chuyển vectơ vào tế bào chủ để biểu hiện. Quá trình này tạo ra thư viện hiển thị phage, có thể nhanh chóng xác định các kháng thể có ái lực cao. Sau đó, thư viện này có thể đóng vai trò là nguồn tài nguyên quý giá cho việc phát triển vắc-xin, thuốc điều trị và thuốc thử chẩn đoán.

Theo nguồn gốc của thư viện kháng thể, thư viện kháng thể phage có thể được phân loại thành thư viện kháng thể phage miễn dịch và thư viện kháng thể phage tự nhiên. Sự khác biệt chính giữa hai loại này nằm ở việc động vật có được tiêm phòng hay không. Ngoài ra, thư viện kháng thể tự nhiên có thể được tạo ra thông qua bán tổng hợp hoặc tổng hợp.

Có hai chỉ số chính để đánh giá chất lượng của thư viện kháng thể: dung lượng lưu trữ và tính đa dạng. Dung lượng lưu trữ lớn, kết hợp với tính đa dạng cao, đảm bảo việc sàng lọc hiệu quả các kháng thể có cả ái lực và tính đặc hiệu cao.

Trong quy trình phân tách sinh học, thư viện protein được ủ với các mục tiêu cố định và sau đó được rửa kỹ để loại bỏ các phage không phản ứng. Các phức hợp thường được tách chiết bằng dung dịch axit hoặc dung dịch có nồng độ muối cao và sau đó được khuếch đại trong các tế bào chủ thích hợp để làm giàu. Sau 3 đến 5 vòng sàng lọc, thu được các kháng thể có ái lực cao.

Các phương pháp sàng lọc phage chủ yếu bao gồm sàng lọc pha rắn, sàng lọc pha lỏng và sàng lọc dựa trên tế bào. Việc lựa chọn phương pháp sàng lọc phù hợp cần xem xét đặc điểm của các phân tử mục tiêu, mục tiêu của quá trình sàng lọc và môi trường phòng thí nghiệm.

Sàng lọc dương tính là phương pháp cơ bản nhất để sàng lọc kháng thể thực khuẩn liên kết với protein mục tiêu. Sàng lọc âm tính giúp loại bỏ các kháng thể không đặc hiệu. Trong quá trình sàng lọc kháng thể thực khuẩn, các kháng thể không đặc hiệu có thể được xác định do sự can thiệp từ nhãn kháng nguyên mục tiêu, vật liệu hoặc các kháng nguyên khác có cấu trúc tương tự với kháng nguyên mục tiêu. Trong những trường hợp như vậy, sàng lọc âm tính có thể nâng cao hiệu quả của quá trình sàng lọc.

Các phương pháp xác minh kháng thể thường bao gồm ELISA, Western Blotting (WB), đo tế bào dòng chảy, kết tủa miễn dịch (IP), miễn dịch huỳnh quang (IF), hóa mô miễn dịch và nhiều kỹ thuật thí nghiệm khác. Alpha Lifetech có kinh nghiệm sâu rộng trong phát hiện kháng thể và sở hữu đội ngũ thí nghiệm chuyên nghiệp, đảm bảo hiệu quả của kháng thể trong các thí nghiệm tiếp theo.