Kỹ thuật tạo kháng thể là gì?

Nhờ kỹ thuật điều chế kháng thể, người ta có thể điều chỉnh kích thước phân tử, dược động học, tính sinh miễn dịch, ái lực liên kết, tính đặc hiệu và chức năng tác động của kháng thể. Sau khi tổng hợp kháng thể, khả năng liên kết đặc hiệu của chúng làm cho chúng trở nên vô cùng quý giá trong chẩn đoán và điều trị lâm sàng. Thông qua kỹ thuật điều chế kháng thể, người ta có thể đáp ứng nhu cầu phát triển thuốc và chẩn đoán ở giai đoạn đầu.

Mục đích của kỹ thuật tạo kháng thể là thiết kế và sản xuất các chức năng ổn định, có tính đặc hiệu cao mà kháng thể tự nhiên không thể đạt được, đặt nền tảng cho việc sản xuất kháng thể điều trị.

Với kinh nghiệm dự án sâu rộng trong lĩnh vực kỹ thuật kháng thể, Alpha Lifetech có thể cung cấp dịch vụ sản xuất kháng thể đơn dòng và đa dòng theo yêu cầu cho nhiều loài, cũng như dịch vụ xây dựng và sàng lọc thư viện kháng thể bằng phương pháp hiển thị phage. Alpha Lifetech có thể cung cấp cho khách hàng các kháng thể sinh học tương tự và các sản phẩm protein tái tổ hợp chất lượng cao, cùng với các dịch vụ tương ứng, để sản xuất các kháng thể hiệu quả, có tính đặc hiệu cao và ổn định. Bằng cách sử dụng các nền tảng kháng thể, protein và hệ thống hiển thị phage toàn diện, chúng tôi cung cấp các dịch vụ bao trùm toàn bộ quy trình sản xuất kháng thể, bao gồm các dịch vụ kỹ thuật như nhân hóa kháng thể, tinh chế kháng thể, giải trình tự kháng thể và kiểm định kháng thể.

Giai đoạn tiên phong của kỹ thuật tạo kháng thể liên quan đến hai công nghệ:

--Công nghệ ADN tái tổ hợp

Công nghệ lai tế bào (Hybridoma)

Sự phát triển nhanh chóng của kỹ thuật tạo kháng thể có liên quan đến ba công nghệ quan trọng:

Công nghệ nhân bản gen và phản ứng chuỗi polymerase

--Biểu hiện protein: Protein tái tổ hợp được sản xuất bằng các hệ thống biểu hiện như nấm men, virus hình que và thực vật.

--Thiết kế kết cấu hỗ trợ bằng máy tính

Thế hệ kháng thể đầu tiên được nhân hóa để sản xuất kháng thể lai, trong đó vùng biến đổi của kháng thể đơn dòng chuột được liên kết với vùng hằng định của phân tử IgG người. Vùng gắn kết kháng nguyên (CDR) của kháng thể đơn dòng chuột thế hệ thứ hai được cấy ghép vào IgG người. Ngoại trừ vùng CDR, hầu hết các kháng thể khác đều là kháng thể người, và người ta đã nỗ lực tránh gây ra phản ứng kháng thể kháng chuột ở người (HAMA) khi sử dụng kháng thể nhân bản từ chuột để điều trị cho người.

 

Để xây dựng thư viện hiển thị phage, bước đầu tiên là thu được các gen mã hóa kháng thể, có thể được phân lập từ tế bào B của động vật được miễn dịch (xây dựng thư viện miễn dịch), chiết xuất trực tiếp từ động vật không được miễn dịch (xây dựng thư viện tự nhiên), hoặc thậm chí được lắp ráp trong ống nghiệm với các đoạn gen kháng thể (xây dựng thư viện tổng hợp). Sau đó, các gen được khuếch đại bằng PCR, chèn vào plasmid và biểu hiện trong các hệ thống vật chủ phù hợp (biểu hiện ở nấm men (thường là Pichia pastoris), biểu hiện ở sinh vật nhân sơ (thường là E. coli), biểu hiện ở tế bào động vật có vú, biểu hiện ở tế bào thực vật và biểu hiện ở tế bào côn trùng bị nhiễm virus hình que). Phổ biến nhất là hệ thống biểu hiện ở E. coli, tích hợp trình tự mã hóa kháng thể đặc hiệu lên phage và mã hóa một trong các protein vỏ phage (pIII hoặc pVIII). Sự kết hợp gen này được hiển thị trên bề mặt của vi khuẩn thể. Cốt lõi của công nghệ này là xây dựng thư viện hiển thị phage, có ưu điểm hơn thư viện tự nhiên ở chỗ nó có thể có sự liên kết đặc hiệu. Tiếp theo, các kháng thể có tính đặc hiệu với kháng nguyên được sàng lọc thông qua quy trình chọn lọc sinh học, các kháng nguyên mục tiêu được cố định, các phage không liên kết được rửa sạch nhiều lần, và các phage liên kết cũng được rửa sạch để làm giàu thêm. Sau ba vòng lặp trở lên, các kháng thể có tính đặc hiệu và ái lực cao sẽ được phân lập.

Hình 3: Xây dựng và sàng lọc thư viện kháng thể

Công nghệ ADN tái tổ hợp có thể được sử dụng để tạo ra các mảnh kháng thể. Kháng thể Fab ban đầu chỉ có thể bị thủy phân bởi protease dạ dày để tạo ra các mảnh (Fab')2, sau đó được tiêu hóa bởi papain để tạo ra các mảnh Fab riêng lẻ. Mảnh Fv bao gồm VH và VL, có độ ổn định kém do thiếu liên kết disulfide. Do đó, VH và VL được liên kết với nhau thông qua một peptide ngắn gồm 15-20 axit amin để tạo thành kháng thể mảnh biến đổi chuỗi đơn (scFv) với trọng lượng phân tử khoảng 25KDa.

Nghiên cứu cấu trúc kháng thể ở họ Camelidae (Lạc đà, Lai và Alpaca) đã làm sáng tỏ rằng kháng thể chỉ có chuỗi nặng và không có chuỗi nhẹ, do đó chúng được gọi là kháng thể chuỗi nặng (hcAb). Vùng biến đổi của kháng thể chuỗi nặng được gọi là kháng thể đơn miền, nanobody hoặc VHH, với kích thước từ 12-15 kDa. Là các monome, chúng không có liên kết disulfide và rất ổn định, với ái lực rất cao đối với kháng nguyên.

Hình 5: Kháng thể chuỗi nặng và VHH/Nanobody

Phương pháp biểu hiện không cần tế bào sử dụng sự biểu hiện của DNA tự nhiên hoặc tổng hợp để đạt được quá trình tổng hợp protein trong ống nghiệm, thường sử dụng hệ thống biểu hiện E. coli. Phương pháp này sản xuất protein nhanh chóng và tránh được gánh nặng về trao đổi chất và độc tính đối với tế bào khi sản xuất một lượng lớn protein tái tổ hợp trong cơ thể sống. Nó cũng có thể sản xuất các protein khó tổng hợp, chẳng hạn như những protein khó sửa đổi sau quá trình dịch mã hoặc khó tổng hợp protein màng.