Nền tảng phân loại tế bào B đơn lẻ

Kháng thể đơn dòng (mAb) là tiên phong trong lĩnh vực thuốc kháng thể, với hơn 100 loại kháng thể đơn dòng đã được phê duyệt để điều trị ung thư, bệnh truyền nhiễm, có thị trường phát triển thuốc riêng và thể hiện giá trị điều trị độc đáo của chúng. Công nghệ kháng thể tế bào B đơn lẻ, là công nghệ phát triển kháng thể thế hệ mới, có thể phân lập kháng thể từ tế bào B đơn lẻ một cách hiệu quả và nhanh chóng, đây là một bước đột phá trong công nghệ sản xuất kháng thể sau công nghệ lai tế bào và hiển thị phage. Công nghệ phân loại tế bào B đơn lẻ có thể được sử dụng để tạo ra kháng thể chống lại nhiều loài như thỏ, chuột, lạc đà, cừu và gà. Công nghệ tế bào B đơn lẻ có những ưu điểm vượt trội như tính đặc hiệu cao, hoạt tính cao và ái lực cao. Dựa trên nền tảng phân loại tế bào B đơn lẻ, Alpha Lifetech có lợi thế về thời gian sàng lọc và thu được kháng thể chất lượng cao. Công ty có thể cung cấp thiết kế, tổng hợp và sửa đổi kháng nguyên, miễn dịch động vật, sàng lọc làm giàu tế bào B đơn lẻ, giải trình tự tế bào đơn lẻ, sàng lọc thông lượng cao, biểu hiện và tinh chế, dịch vụ kỹ thuật trọn gói như xác minh chức năng để đáp ứng nhu cầu đa dạng của khách hàng.

Tóm tắt các kỹ thuật sàng lọc tế bào B đơn lẻ

Các phương pháp sàng lọc tế bào B đơn lẻ chủ yếu được chia thành phương pháp phân lập ngẫu nhiên và phương pháp phân lập chọn lọc kháng nguyên. Phương pháp phân lập ngẫu nhiên áp dụng cho các mẫu có nồng độ cao, trong khi phương pháp phân lập chọn lọc kháng nguyên chỉ phân tách tế bào B. Phương pháp này đơn giản nhưng đòi hỏi nhiều công sức, và thường được sử dụng làm bước đầu tiên của quá trình phân lập đặc hiệu kháng nguyên. Phương pháp phân lập đặc hiệu kháng nguyên phù hợp với trường hợp hàm lượng kháng thể đặc hiệu như kháng thể chống ung thư và kháng thể tự miễn dịch thấp. Việc phân lập tế bào B đặc hiệu bằng cách sử dụng nguyên lý miễn dịch về sự liên kết đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể với mẫu ban đầu tương đối phức tạp. Bảng dưới đây thể hiện các phương pháp phân loại thường dùng và ưu nhược điểm của chúng.

	Các phương pháp tiếp cận	Thuận lợi	Nhược điểm
Ngẫu nhiên Sự cách ly	Thao tác vi mô	Yêu cầu thiết bị thấp Thao tác đơn giản	Hiệu suất thấp Các loại tế bào riêng lẻ có số lượng hạn chế
	vi phẫu thuật bắt giữ bằng laser	Độ chính xác vị trí cao Thao tác đơn giản Chọn lọc trực quan các tế bào tương tự từ mẫu và loại bỏ tạp chất.	Quy trình chuẩn bị mẫu phức tạp Không có khả năng tự động hóa
	Phân loại tế bào bằng huỳnh quang	Độ chính xác và hiệu quả cao Mức độ tự động hóa cao Ứng dụng rộng rãi	Ca phẫu thuật phức tạp Yêu cầu trang thiết bị cao
Phân lập chọn lọc kháng nguyên	Kháng nguyên được gắn huỳnh quang thông qua đa tham số	Độ chính xác và hiệu quả cao Mức độ tự động hóa cao Thông lượng cao và đa tham số Khả năng phân lập tế bào B ở các giai đoạn khác nhau	Ca phẫu thuật phức tạp Yêu cầu trang thiết bị cao
	Hạt từ tính được phủ kháng nguyên	Thao tác đơn giản Độ lặp lại cao Có thể làm giàu tế bào B mục tiêu	Ca phẫu thuật phức tạp Các hạt từ tính ảnh hưởng đến hoạt động sinh học của tế bào và không thuận lợi cho việc nuôi cấy và thao tác sau khi phân lập.
	Khắc siêu nhỏ	Hiệu quả cao Tốc độ cao	Yêu cầu trang thiết bị cao Hiệu suất thấp
	Xét nghiệm mảng Immunospot trên chip	Mức độ tự động hóa cao Độ chính xác và hiệu quả cao	Ca phẫu thuật phức tạp Chi phí cao

Quy trình dịch vụ sàng lọc kháng thể tế bào B đơn lẻ

Tiêm chủng cho động vật

Chọn kháng nguyên thích hợp cho động vật thí nghiệm (như chuột, thỏ, v.v.) để kích thích hệ miễn dịch, nhằm giúp chúng sản sinh kháng thể đặc hiệu chống lại kháng nguyên đó.

Tiêm chủng cho động vật là giai đoạn đầu tiên của quá trình tạo kháng thể. Tiêm chủng cho động vật là việc sử dụng cơ chế đáp ứng miễn dịch dịch thể của chính cơ thể, thông qua sự kích thích liên tục của kháng nguyên, động vật tạo ra phản ứng miễn dịch mạnh mẽ, và sau đó tiết ra các kháng thể đặc hiệu chống lại các kháng nguyên đặc hiệu.

Thu thập và làm giàu tế bào B

Tế bào B được phân lập từ máu ngoại vi, lá lách hoặc hạch bạch huyết của động vật miễn dịch. Các tế bào B này đã được kích thích miễn dịch để sản sinh kháng thể chống lại các kháng nguyên đặc hiệu.

Bằng các phương pháp vật lý hoặc hóa học (như ly tâm theo gradient mật độ, tách bằng hạt từ tính, v.v.), làm giàu tế bào B, loại bỏ các tế bào tạp chất, cải thiện độ tinh khiết của tế bào B và hiệu quả của quá trình tách tiếp theo.

Hình 1. Nhân bản và điều chế kháng thể đơn dòng từ thỏ. Nguồn tham khảo:Nhân bản tế bào B đơn lẻ và sản xuất kháng thể đơn dòng từ thỏ.)

Phân loại tế bào B

Các kỹ thuật sàng lọc tốc độ cao như phân loại tế bào bằng huỳnh quang (FACS), tách tế bào bằng từ tính (MACS), phân loại tế bào vi lưu (MCS) hoặc các kỹ thuật khác, kết hợp với việc gắn nhãn đặc hiệu kháng nguyên, có thể được sử dụng để sàng lọc các tế bào B riêng lẻ từ các tế bào B đã được làm giàu nhằm sản xuất kháng thể nhắm mục tiêu.

Khi một tế bào B đơn lẻ được phân lập từ quần thể tế bào B hỗn hợp, các gen kháng thể của nó cần được giải trình tự bằng công nghệ giải trình tự tế bào đơn và phân tích để thu được thông tin trình tự DNA của vùng biến đổi chuỗi nặng (VH) và vùng biến đổi chuỗi nhẹ (VL). Công nghệ giải trình tự tế bào đơn chủ yếu bao gồm ba bước: phân lập tế bào đơn, khuếch đại axit nucleic nội bào và phân tích trình tự. Nguyên tắc của giải trình tự tế bào đơn là khuếch đại lượng DNA hoặc RNA toàn bộ hệ gen vết của các tế bào đơn lẻ được phân lập để thu được bộ gen hoặc bộ phiên mã hoàn chỉnh với độ phủ cao cho giải trình tự thông lượng cao.

Thông qua sàng lọc tốc độ cao, trình tự gen kháng thể của hàng ngàn tế bào B có thể được thu thập cùng một lúc, giúp tăng tốc đáng kể quá trình phát hiện kháng thể. Thông tin trình tự này có thể được sử dụng tiếp tục để xây dựng và sàng lọc thư viện kháng thể.

Hình 2. Sơ đồ mô tả quá trình thu nhận tế bào B đơn lẻ, xây dựng thư viện, sàng lọc tốc độ cao và giải trình tự.(Nguồn tham khảo: Giải trình tự thụ thể tế bào B đơn bào song song quy mô lớn cho phép phát hiện nhanh chóng nhiều loại kháng thể phản ứng với kháng nguyên khác nhau..)

Khuếch đại gen kháng thể

Một tế bào B đơn lẻ được phân chia để giải phóng mRNA. Sau đó, trình tự cDNA của vùng biến đổi chuỗi nặng (VH) và vùng biến đổi chuỗi nhẹ (VL) được khuếch đại bằng phản ứng phiên mã ngược-polymerase chuỗi (RT-PCR).

Biểu hiện và tinh chế kháng thể

Gen vùng biến đổi được khuếch đại được chèn vào plasmid vector chứa gen vùng hằng định để tạo ra plasmid biểu hiện kháng thể đơn dòng. Sau đó, hệ thống biểu hiện thích hợp (hệ thống biểu hiện tế bào nhân chuẩn như tế bào CHO hoặc hệ thống biểu hiện tế bào nhân sơ như Escherichia coli) được lựa chọn để biểu hiện, và thu được kháng thể đơn dòng có hoạt tính sinh học. Phương pháp sắc ký ái lực protein A được sử dụng để chiết xuất và tinh chế các kháng thể được biểu hiện từ nuôi cấy tế bào và thu được kháng thể đơn dòng tái tổ hợp chất lượng cao.

Xác nhận kháng thể

Việc thẩm định kháng thể về tính đặc hiệu, ái lực và hoạt tính sinh học bằng các phương pháp ELISA, Western blot, phân tích dòng chảy và kết tủa miễn dịch nhằm đảm bảo hiệu quả của kháng thể đáp ứng kỳ vọng. Thẩm định kháng thể là bước quan trọng để đảm bảo chất lượng và độ tin cậy của kháng thể.

Các yêu cầu đối với chất gây miễn dịch

(1)Protein tái tổ hợp: ≥2,5 mg, độ tinh khiết protein >85%, trọng lượng phân tử protein lớn hơn 10 kDa, nồng độ protein hòa tan từ 0,5 đến 5 mg/mL. Nếu cần tinh chế ái lực kháng nguyên, cần thêm 10 mg protein tái tổ hợp.

(2)Polypeptide và phân tử nhỏ: Peptide trần ≥10 mg, độ tinh khiết của peptide >90%, không ít hơn 10 AA, liên kết với KLH/BSA/OVA hoặc các protein mang khác; Các phân tử nhỏ cần được đánh giá cấu trúc trước.

Quy trình dịch vụ phân loại tế bào B đơn lẻ

Các bước	Nội dung dịch vụ	Dòng thời gian
Bước 1: Tiêm chủng cho động vật và phát hiện bằng phương pháp ELISA	(1) Động vật được tiêm chủng 4-5 lần, bắt đầu từ liều thứ 4, huyết thanh được thu thập để phát hiện hiệu giá kháng thể bằng ELISA (hiệu giá huyết thanh ELISA kháng nguyên protein >10^5; hiệu giá huyết thanh ELISA kháng nguyên peptide >10^4). Đồng thời, 0,1ml huyết thanh trước và sau tiêm chủng được gửi đến khách hàng để xét nghiệm; Nếu nồng độ kháng thể không đạt yêu cầu, việc tiêm chủng sẽ tiếp tục hoặc khách hàng yêu cầu chấm dứt dự án, và chỉ phần tiêm chủng sẽ bị tính phí; (2) Nếu nồng độ đạt yêu cầu, tế bào PBMC được phân lập từ máu toàn phần.	10-12 tuần
Bước 2: Phân loại tế bào B đơn lẻ	(1)Lá lách được thu thập, dịch huyền phù tế bào B đơn được chuẩn bị, máu ngoại vi được thu thập và các tế bào PBMC được phân lập. (2) Các dấu hiệu kháng nguyên miễn dịch FITC và AF648. (3) Phân loại dòng huỳnh quang kép + nuôi cấy dòng tế bào b đơn lẻ. (4)Xác định ELISA + giải trình tự các dòng dương tính.	2-3 tuần
Bước 3: Biểu hiện và xác nhận kháng thể	(1) Tổng hợp gen trình tự 6-10 + xác nhận thử nghiệm biểu hiện ở động vật có vú. (2) Nhận dạng ELISA.	3-4 tuần
Bước 4: Giao hàng	(1) Trình tự kháng thể: 4-6 trình tự kháng thể (các trình tự không được biểu hiện được cung cấp cùng nhau). (2) Mỗi chuỗi biểu hiện cung cấp 0,2mg kháng thể. (3) Báo cáo thí nghiệm.	1 tuần