De formulering van het immunisatieprogramma is gebaseerd op de zuiverheid en eigenschappen van het gezuiverde antigeen. Muizen moeten 8-10 weken vóór de fusie antigeenimmunisatie ontvangen om een ​​sterke immuunrespons te stimuleren en zich voor te bereiden op de daaropvolgende hybridomaproductie. Het injectieschema werd aangepast op basis van het type antigeen en andere factoren. Vóór de immunisatie werd het serum van de muizen verzameld als basiscontrole. Bloed werd verzameld uit de punt van de staart en er werd 100-200 μL bloed verzameld. Serum werd afgescheiden en ingevroren. Een typisch immunisatieprogramma omvat intraperitoneale injectie van 2-4 volwassen muizen (zoals BALB/c-muizen), met een interval van 21 dagen tussen de primaire immunisatie en secundaire immunisatie, gevolgd door een interval van 14 dagen voor elke immunisatie, in totaal 4 immunisaties en 1-3 boosterimmunisaties totdat een ideale antilichaamtiter is verkregen. Zeven dagen na de laatste injectie werd het serum opnieuw verzameld en werd het antilichaamniveau bepaald met ELISA. De muizen met de hoogste antilichaamtiter werden geselecteerd voor fusie. 1-4 dagen voor de fusie werd bij geselecteerde muizen een injectie in de staartader uitgevoerd.

Myeloomcellen moeten continu en selectief groeien door de groei van parentale myeloomcellen in kweek te remmen. Parentale myeloomcellen waarvan is aangetoond dat ze stabiele hybridomen produceren, zijn geselecteerd en deze cellen hebben het vermogen verloren om nucleotiden te produceren via remediërende routes. Vóór de fusie werden parentale myeloomcellen minstens een week gekweekt om zich aan te passen aan HGPRT-negatieve omstandigheden, en cellen die in de vroege logaritmische fase groeiden, werden geselecteerd voor fusie. Na de fusie werd aminopterine gebruikt om de de novo syntheseroute te blokkeren, zodat myeloomcellen geen RNA of DNA konden produceren en afstierven, terwijl hybridoomcellen konden groeien in HAT-selectief medium met hypoxanthine, aminopterine en thymidine.

De ouderlijke myeloomcellen die hybridomen produceren, moeten overeenkomen met de geïmmuniseerde muizenstam en geen auto-immunoglobulineketens afscheiden. Controleer vóór de fusie of de ouderlijke myeloomcellen vrij zijn van mycoplasmacontaminatie, of de fusie goed is, of ze een stabiel hybridoom kunnen vormen en of ze specifieke monoklonale antilichamen blijven afscheiden. Fusie kan worden geïnduceerd met fysische reagentia (zoals elektrofusie) of chemische reagentia (zoals polyethyleenglycol, calciumionen). 48-72 uur vóór de fusie werden de geïmmuniseerde muizen geëuthanaseerd en werden de milten verwijderd en afgebroken tot individuele celsuspensies. Tegelijkertijd werden de myeloomcellen geoogst en gemengd met miltcellen en fusiereagentia om hybridoomkolonies te produceren. De gefuseerde cellen werden verspreid op een kweekplaat met een voedingslaag.

7-14 dagen na de fusie werd interleukine-6 ​​(IL-6) toegevoegd om de groei van hybridomen te bevorderen. Na 7 dagen stierven de ongefuseerde myelomacellen af ​​onder invloed van aminopterine. Hybridomen die antilichamen afscheidden, werden gescreend met flowcytometrie of ELISA. De geselecteerde hybridomen werden gekloond en opnieuw gekloond om een ​​zuivere kloonpopulatie te verkrijgen. De geselecteerde hybridomen kunnen worden ingevroren in vloeibare stikstof voor toekomstig onderzoek.

De faagdisplaytechnologie werd voor het eerst uitgevonden in 1985 om polypeptiden te presenteren. In 1990 werden antilichaamfragmenten voor het eerst op fagen gepresenteerd. Deze displaymethode maakt het mogelijk om exogene fragmenten te herkennen door specifieke antilichamen of andere liganden. Zo kunnen exogene fragmenten worden gescreend en geïdentificeerd.

Dit proces begint met de samenstelling van een antilichaambibliotheek, waarvan de kern bestaat uit het verkrijgen van hoogwaardig RNA uit geselecteerde cellen (zoals mononucleaire cellen uit perifeer bloed). Vervolgens werden deze RNA's omgekeerd getranscribeerd tot cDNA's, die werden gebruikt om te coderen voor de variabele regio van de zware keten (VH) en de variabele regio van de lichte keten (VL) van het antilichaam. De variabele regio's van alle transcriptherschikkingen in een bepaalde immunoglobulinebibliotheek werden geamplificeerd met behulp van primers voor specifieke VH- en VL-genfamilies. Deze geamplificeerde producten werden geligeerd in de faagdisplayvector in de geconstrueerde faagdisplayvector, die VH en VL tot expressie bracht als scFv en fuseerde met het pIII secundaire capside-eiwit van de filamenteuze faag van Escherichia coli (M13-faag) om een ​​bibliotheek te construeren die de specificiteit van alle antilichamen in een specifiek individu weerspiegelt. De varianten van fagedisplaybibliotheken omvatten bibliotheken die zijn geconstrueerd voor verschillende Ig-isovormen (zoals IgG, IgA en IgE) en monoklonale antilichaam (mAb)-bibliotheken die tot expressie worden gebracht als Fab-fragmenten of enkelvoudige variabele fragmenten (scFv).

Verschillende antilichaamfaagdisplaybibliotheken werden gegenereerd uit ongeveer 10 ^ 8 onafhankelijke E. coli-transformanten. Door middel van meerdere rondes van faag-antigeenbinding, wassen, elutie en recombinatie werden niet-specifieke antilichaamfagen weggespoeld en bindende faagklonen selectief geëlueerd. Na 5 of 6 screeningsrondes worden de faagklonen aangestuurd om het gefixeerde antigeen te selecteren door de zeer specifieke binding van het monoklonale antilichaam aan het oppervlak.

Marktperspectief van monoklonale antilichaamtherapieANTILICHAAM

Voordelen van de productie van monoklonale antilichamenANTILICHAAM

Alpha Lifetech garandeert de productie van monoklonale antilichamen met uitzonderlijke affiniteit en specificiteit, waardoor ze zeer betrouwbaar zijn voor verschillende toepassingen, waaronder diagnostiek, therapie en onderzoek.